两种方法处理冷凝标本的结果分析

洪华林 ，严莉 ，沈燕

（1.长兴县中医院，浙江 湖州 313100；2.浙江省人民医院，浙江 杭州 310014）

在实际工作中，影响血细胞分析仪检测结果准确性的因素始终存在，包括仪器、试剂、环境温度、人为因素、病理因素以及规章制度等[1]。比如冷凝集样本对血细胞分析仪的检测参数、散点图和直方图均有明显干扰，导致多项检测结果与真实结果并不相符，解决冷凝集对全自动血细胞分析仪检测结果的影响以往多使用水浴法[2-4]，但当含有高效价冷凝集素的标本时，水浴法往往不能有效解决此问题。在工作中发现多次使用Sysmex-XS500i稀释模式加水浴法能更快、更好地处理高效价凝集标本，现对直接水浴仪器法测定结果与预稀释再水浴仪器法作比较，报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 1例于2018年3月20日夜间因急性呼吸道感染到长兴县中医院就诊患者，男，65岁。血常规检查：RBC 为 1.18×1012/L，HGB 为 131g/L，WBC 为 9.92×109/L，PLT 为 199×109/L，血细胞比容（Hct）为 12.3%，红细胞平均容积（MCV）104.2fL，红细胞平均血红蛋白量（MCH）为110.0pg，红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）为1065g/L。急诊Sysmex-XS500i血细胞分析仪报警提示红细胞双峰、红细胞凝集。肉眼可见抗凝管内壁有较多凝集颗粒，呈磨砂状，标本制作血涂片，瑞-姬氏染色发现RBC大量聚集成块。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 日本Sysmex-XS500i全自动血液分析仪及其配套试剂和校准物以及国产质控品，上海博迅HHS型电热恒温水浴箱，奥林巴斯CX31双目显微镜。

1.2.2 检测方法 分析前Sysmex-XS500i高、低两个水平的室内质控，质控品来源于山东烟台卓越生物科技有限公司。将用EDTA-K2抗凝的急诊冷凝集标本分为2等份。其中一份标本分成10小等份，不做稀释处理，放入37℃水浴箱温育不同时间后立即用Sysmex-XS500i检测2次，结果取平均值；另一份标本按Sysmex-XS500i稀释模式1:7比例稀释处理，再分成10等份，同样放入37℃水浴箱温育不同时间后立即用Sysmex-XS500i稀释模块同样检测2次，结果取平均值。仪器检测前肉眼观察20份标本，完成检测后立即制作血涂片，瑞-姬氏染色观察红细胞聚集情况。

1.3 统计学处理 以《WS/T406-2012临床血液学检验常规项目分析质量要求》中的比对试验接受标准作为判断差异大小的标准，比较直接水浴仪器法与预稀释再水浴仪器法测定结果的差异。

2 结果

2.1 仪器检测 从表1中可知：（1）两种方法处理后水浴相同时间内WBC结果差异较明显（大于规定标准7.5%），同一方法水浴不同时间WBC变化较小（小于规定标准7.5%）；（2）两种方法处理后水浴相同时间内RBC结果差异较明显，（大于规定标准3.0%），同一方法水浴不同时间，A组变化较小，B组在水浴5分钟后变化明显，两者随着水浴时间的延长，RBC计数慢慢增高，与起始水浴的情况相比差异较明显；（3）HBG无论是不同方法还是不同时间，结果均较稳定（小于规定标准3.5%）；（4）Hct变化与 RBC 相似；（5）MCV 与 HGB 相似；（6）MCH与MCHC变化趋势大致相同，即两种方法处理后水浴相同时间内MCH与MCHC结果差异较明显（大于规定标准3.5%），同一方法水浴不同时间A组变化较小，B组水浴5分钟后变化明显，两者随着水浴时间的延长，MCH与MCHC呈降低趋势，与起始水浴的情况相比差异较明显；（7）PLT经两种方法处理后水浴相同时间内结果差异较明显（大于规定标准12.5%），未稀释水浴法处理标本后，水浴不同时间PLT变化不大（小于规定标准12.5%），而预稀释水浴法随着水浴时间延长PLT计数呈升高趋势，与起始情况相比差异较明显。

表1 两种不同方法处理冷凝集标本检测结果

2.2 肉眼观察及瑞-姬氏染色镜检 肉眼观察时，直接水浴标本（A组）始终能看到磨砂状的肉眼凝集（图1），而预稀释再水浴标本（B组）一开始有磨砂状凝集，5分钟后即消失（图2）；标本血涂片镜检下，A组始终能看到大片聚集现象（图3）；B组很难观察到肉眼凝集，血涂片除最初阶段有少量凝集之外，后续时间红细胞聚集少见或者未见（图4-5）。详见表2。

3 讨论

冷凝集是指由冷凝集素引起的RBC在低温环境下凝集成团的现象。冷凝集反应一般出现在30℃以下，0～4℃时最强，尤以RBC凝集最为明显[5]。冷凝集素是一种针对RBC膜抗原的IgM型自身抗体，是一种可逆性抗体，在低温时可与自身RBC、“O”型RBC发生冷凝集，温度提高后凝集可消失。健康人血液中可存在低滴度的冷凝集素，其滴度往往在1:16以下[6]，一般不引起RBC凝集，但当冷凝集素滴度明显增高时，则可引起比较严重的RBC凝集。自身免疫性疾病、支原体感染、非特异性炎症、传染性单核细胞增多症及浆细胞瘤等可引起冷凝集素滴度轻度增高（特殊情况下可以明显增高），而高滴度冷凝集素主要见于原发性冷凝集素综合征[7]。冷凝集现象会干扰血细胞分析仪检测，对血常规多项参数造成不同程度的影响。通过对比分析具有冷凝集现象的血标本经过不同处理方式在37℃水浴前、后各参数的检测结果变化，以RBC、Hct、MCH、MCHC等参数受冷凝集的影响最为敏感，其次为WBC、PLT（造成其结果降低）。冷凝集现象可引起RBC、Hct结果明显减低，但HGB结果无明显变化，使RBC、Hct与HGB的关系严重不符，造成MCH、MCHC 结果显著增高[8]。

目前，处理冷凝集的报道多偏向于热水浴的方法和血浆置换法。但血浆置换法操作比较繁琐，且操作过程中会造成WBC、PLT有所减少，需要手工校正[7]。本研究建议对水浴法不能完全消除干扰的冷凝集标本，可采用预稀释水浴法，并用Sysmex-XS500i稀释模块检测。本实验结果显示，经过以上方法，WBC、RBC、Hct、MCH、MCHC、PLT 与未稀释水浴结果比较偏倚分别大于7.5%、3.0%、3.5%、3.5%、3.5%、12.5%，效果明显，而且操作方便，在预稀释水浴25～30分钟后各参数趋于稳定。主要原因在于1:7稀释标本时，降低了标本的凝集效价，增加了细胞间的距离，降低了细胞表面电荷的作用，从而减少细胞间的聚集，降低冷凝集素的干扰[7]。涂片显微镜下观察显示，红细胞无凝集现象，上机检测时血常规各项参数检测结果均恢复正常，直方图恢复正常，Sysmex-XS500i无报警提示。王加勇等[9]研究过使用血液分析仪Sysmex-XN9000预稀释再水浴处理冷凝集标本，效果显著，符合美国实验室修正法规（CLIA’88）规定的室间质量评价要求。需要注意的是，稀释时比例必须严格按照稀释模式比例进行，并选择良好的量具，否则会造成较大误差。

综上所述，对怀疑有冷凝集的标本，上机检测前应仔细观察每份血常规标本的外观，当摇动血液时，观察到管壁上有明显的磨砂状的凝集颗粒应将血标本预稀释置37℃水浴25～30分钟，待冷凝集现象消除后，立即上机检测。因此，在日常工作中要自觉地按实验要求对每份血细胞检测结果仔细分析，在审核报告单时，除了重点审查WBC、RBC、HGB、PLT等主要指标外，还需核对MCH、MCHC等指标，当MCH与MCHC明显增高时，且观察到散点图、直方图异常及仪器报警提示，往往表示有冷凝集现象。如发现冷凝集标本，应密切结合临床，查明原因，通过预稀释37℃水浴25～30分钟等方法排除干扰，防止检验报告错误，影响临床诊疗。