逍遥合剂对产后抑郁症模型大鼠行为学、神经递质及ERK1/2通路影响的研究*

张世娇，王娜梅，王慧霞

河南中医药大学第三附属医院(郑州 450003)

主题词 抑郁症，产后 动物实验 大鼠

随着不断加快的生活节奏、加大的工作压力，产后抑郁症(PPD)患病率呈逐年上升趋势[1-2]。有报道称世界卫生组织数据显示，抑郁症已成为影响人类生活的第二大疾病[3]。祖国医学认为抑郁最开始是气滞，后出现痰结、食滞、火郁及血瘀等，产妇“多虚多瘀”，病情日久不愈，影响气血阴阳，导致肝、脾、肾等重要脏器的病变。本病治则主以疏肝健脾，根据此法制成“逍遥合剂”，具有疏肝健脾养血等功效。有学者发现，抑郁症与多种神经递质存在一定的相关性[4]。已有研究证实细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的其中一条，与抑郁症有密切联系，起重要作用，越来越受到研究学者的关注[5]。因此，本次研究针对产后抑郁“肝郁脾虚”病证，提出“疏肝健脾法”治疗产后抑郁。本次研究以ERK1/2通路为切入点，探讨逍遥合剂对产后抑郁症模型大鼠行为学、神经递质的作用。

材料与方法

1 材 料

1.1 实验动物：SPF级正常SD雌性大鼠72只，5～6周龄，体重160～180 g，均购于上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格证编号：SCXK(沪) 20140125。实验动物均饲养于本院(25±2)℃的屏障实验室内，每12 h光照明暗交替，实验前适应性饲养1周，实验方案经过本院医院伦理委员会审核，伦理编号： AESI-2016-0325，实验研究均符合中国伦理委员会中关于动物研究原则。

1.2 实验药物及试剂：逍遥合剂(主要药物：柴胡、白芍、茯苓各20 g，当归、生姜各15 g，薄荷、大枣各10 g,本院院内制剂)，盐酸氟西汀(国药准字：H41012925，批号：20160821)，苯甲酸雌二醇注射液(国药准字：H42032116，批号：20160516)，黄体酮注射液(国药准字：H71022318，批号：20160623)，MEK1一抗及p-MEK1一抗(国药准字：H62012423，H56023146;批号：ab31034，ab8621)。

1.3 实验主要仪器：X射线胶片洗片机(购买于德国Protec公司)；Mini-protean型小型垂直电泳槽及M2000 多功能酶标仪(购买于美国Bio-Rad公司)；CKX31倒置显微镜(购买于日本 Olympus 公司)；CHOL16M高速台式冷冻离心机(购买于湖南湘仪实验室仪器有限公司)；YP601N 型电子天平(购买于上海精密科学仪器有限公司)。

2 方 法

2.1 分组:SD雌性大鼠喂养1周，采用随机数字表法分6组，分别为：正常组、模型组、逍遥合剂高、中、低剂量组、阳性药组，每组12 只。

2.2 造模与给药：大鼠均进行旷场实验，按体重随机分正常及模型组。模型组实行切除两侧卵巢手术，术后2～5 d行阴道细胞学涂片检查，5 d后将大鼠造模。具体造模：连续16 d在大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇0.1 ml、黄体酮0.2 ml，后连续7 d注射雌二醇0.1 ml，23 d后停止注射，造模动物出现抑郁症状。造模成功后，按旷场随机分6组，正常组、模型组予灌注生理盐水，逍遥合剂高、中、低剂量组的7、3.6、1.8g(kg·d)，相当60 kg成人体重临床等效量、阳性药组即盐酸氟西汀组10 mg(kg·d)，各组均 1次/d，连续灌胃治疗21 d。

2.3 体重指标：在实验开始后的每周三测量大鼠体重，并详细记录。

2.4 行为学指标：采用敞箱(Open-Field)行为评分，具体操作如下：将大鼠放置于黑色长方体内，将敞箱划分9块。在敞箱上悬挂摄像头，用以记录动物日常活动，水平得分：活动总路程；探索得分：中央区域活动路程。每只动物测定1次，每次5 min。

2.5 神经递质：给药治疗21 d后将大鼠腹腔注射麻醉处死，开颅，将下丘脑分离，液氮储存。制备下丘脑标本：从液氮中取出下丘脑后置于4 ℃冰箱解冻，称300 mg，放置研磨器与生理盐水混合，避光，后转移至2 mlEP管，离心15 min，取上清液测定下丘脑中5-HT、NE、DA含量，按ELISA试剂盒说明书要求操作。

2.6 下丘脑中MEK1及p-MEK1蛋白测定：取大鼠下丘脑，液氮研磨，置裂解液中，提取总蛋白，测定蛋白浓度，计算蛋白量上样，并配制凝胶。电泳后将其转移至PVDF膜上，封闭1 h，加入一抗，放置4℃摇床过夜，并洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，HRP显色，选用Image-Pro plus图像分析软件测条带灰度值。

2.7 统计学方法：采用SPSS17.0统计学软件对计量资料进行方差齐性检验，各组间比较，采用单因素方差分析(ANOVA检验)，采用LSD-t和Dunnett T3检验方法，计量资料用均数±标准差表示，P<0.05为有统计学意义。

结 果

1 体 重 3周后，各治疗组大鼠体重均高于模型组体重，且正常组、逍遥合剂高、中剂量组显著高于模型组(P<0.05)，逍遥合剂高剂量组体重显著高于盐酸氟西汀组(P<0.05)，见表1。

注：各组与模型组比较，△P<0.05，与逍遥合剂高剂量组比较，▲P<0.05

2 行为学评分测定 治疗前，各治疗组大鼠行为学指标评分均无统计学意义(P>0.05)，治疗后逍遥合剂高、中剂量组及盐酸氟西汀组的水平移动总路程较模型组有显著差异(P<0.05)，逍遥合剂高、中、低剂量组及盐酸氟西汀组的中央区域路程较模型组有统计学差异(P<0.05)，见表2。

表2 各组行为学评分比较(m)

注：各组与模型组比较，△P<0.05，与高剂量组比较，▲P<0.05

3 各组大鼠治疗21 d下丘脑5-HT、DA、NE水平比较 逍遥合剂高、中剂量组5-HT、DA、NE水平较模型组显著上升(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠治疗21d下丘脑5-HT、DA、NE水平比较

注：各组与模型组比较，△P<0.05，与高剂量组比较，▲P<0.05

4 下丘脑中p-CREB、p-ERK1/2蛋白测定 逍遥合剂高、中剂量组p-CREB、p-ERK1/2蛋白水平较模型组显著上升(P<0.05)，逍遥合剂低剂量组及盐酸氟西汀组较逍遥合剂高剂量组显著降低(P<0.05)，见表4。

表4 各组大鼠治疗21 d下丘脑中p-CREB、p-ERK1/2蛋白比较

注：各组与模型组比较，△P<0.05，与逍遥合剂高剂量组比较，▲P<0.05

讨 论

PPD与典型的抑郁症有所不同，该病的主要临床表现发生在产褥期，以焦虑、激动、不安、失眠、恐惧等为症状[6]。该病发生是由多个方面综合作用的结果，如生理、环境、心理、压力等。产后抑郁动物实验主要以雌鼠行双侧卵巢切除后，并注射雌孕激素，以此来进行妊娠的模拟[7]，在停止给药后，激素水平将发生较快的下降，后根据大鼠旷场实验的得分情况来判断模型是否构建成功[8-9]。有研究显示，ERK1/2通路是MAPK的其中一条，ERK的信号通路转导机制主要有反馈调节、支架蛋白、亚细胞、G蛋白等[10-11]。有研究认为：其信号通路主要表现在雌激素激活BDNF受体酪氨酸激酶B，并激活小分子G蛋白,从而活化 MAPK激酶及ERK1/2，与此同时，核糖体S6激酶也得到相应的激活，环磷腺苷反应元结合蛋白促使其磷酸化，基因转录得到调控，以此来改善产妇抑郁症状[12-13]。有学者认为抑郁与下丘脑中的蛋白水平表达量存在密切的相关性[14]，因此本文以ERK1/2 通路中p-CREB、p-ERK1/2的蛋白水平进行探讨。产后抑郁多考虑“肝郁脾虚”，本次研究针对“肝郁脾虚”病证，提出“疏肝健脾法”用于产后抑郁的治疗。而中药复方逍遥合剂(主要药物组成：柴胡、白芍、茯苓各20 g，当归、生姜各15 g，薄荷、大枣各10 g)符合此治疗原则。柴胡疏肝解郁，现代药理学认为柴胡总皂甙能使肝糖无明显增加，能抑制肾上腺素，诱导脂肪分解，降低脂肪量；芍药总苷可清除氧自由基，抑制肝脏脂质过氧化，当归、白芍养血柔肝，茯苓健脾安神，生姜温胃和中，大枣温以补脾经不足，甘以缓肝急。全方共奏疏肝、健脾之功，药物相得益彰。

本研究各治疗组大鼠体重均高于模型组体重，且正常组、逍遥合剂高、中剂量组显著高于模型组，逍遥合剂高剂量组体重显著高于盐酸氟西汀组，表明逍遥合剂在一定程度上有恢复体重的疗效，且呈现出一定的剂量关系。治疗后，逍遥合剂高、中剂量组及盐酸氟西汀组的水平移动总路程较模型组有显著差异，逍遥合剂高、中、低剂量组及盐酸氟西汀组的中央区域路程较模型组有显著差异。结果显示模型组大鼠获得的Open-Field得分有一定程度的下降，表明PDD模型有活动度的降低，这与医护人员在临床上所见PDD患者症状基本相一致。而逍遥合剂高、中剂量组可显著改善PDD模型大鼠的行为学，有临床利用价值。逍遥合剂高、中剂量组5-HT、DA、NE水平较模型组显著上升。有研究认为抑郁症与神经递质存在密切联系，神经递质浓度不足，引起患者精神及心理功能有所下降[15-17]。而本次结果表明逍遥合剂高、中剂量组具有抗抑郁作用，能缓解由于PDD引起的异常神经递质分泌。逍遥合剂高、中剂量组p-CREB、p-ERK1/2蛋白水平较模型组显著上升，逍遥合剂低剂量组及盐酸氟西汀组较逍遥合剂高剂量组显著降低。在本文中，产后抑郁模型的p-CREB、p-ERK1/2含量显著降低。而逍遥合剂高、中剂量组可显著提高抑郁大鼠p-CREB、p-ERK1/2的水平。推测可能是由于将模型大鼠的卵巢切除后，其体内的雌激素降低，使其反应元件减弱，下调BDNF及TrKB分子蛋白，最后使MEK1活化降低，发生抑郁[18]。在予逍遥合剂高、中、低剂量及盐酸氟西汀治疗后，其指标显著上升，均有改善，表现出阳性结果，但都较正常组降低。该结果在一定程度上表明对于产后抑郁，采用疏肝健脾法治疗，结合于BDNF的反应元件，激活ERK1/2 信号上的蛋白，产生效应，改善抑郁症状，表明逍遥合剂可能通过ERK1/2通路来调控并改善抑郁。

综上所述，逍遥合剂能有效改善产后抑郁模型大鼠行为学各项指标，可能是通过上调下丘脑神经递质及ERK1/2信号通路上p-MEK1、MEK1蛋白水平来缓解抑郁症状。