不同用途酵母菌株环境适应性差异研究

王学东， 周建军， 付国静,， 胡骏鹏， 刘 琼，胡先勤， 罗青平， 王海燕， 孙 敏

（1.武汉轻工大学，湖北武汉 430023；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；3.思科福（北京）生物科技有限公司，北京 100081；4.农业部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室，湖北武汉 430064；5.北京挑战生物技术有限公司，北京 100081）

饲用酵母能促进动物新陈代谢，增强食欲，有利于动物的消化吸收，加速动物的生长发育及生产性能的发挥，还能提高动物的抗病、防病能力（Hatoum等，2012）。作为一株优良的饲用酵母，其应能够耐受动物消化道内高酸性、高浓度胆酸盐的恶劣环境，并具有产气量小，发酵稳定等优点（谭斌，2008）。本研究选取不同用途酵母菌株，对其环境抗逆性，即酸胁迫耐受性和胆酸盐耐受性进行研究，初步探讨造成不同酵母菌株此种差异的环境抗逆性机理，并对其产气能力进行对比，研究不同用途酵母菌株产气能力的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 无糖酵母 （无糖高活性干酵母）、耐高糖酵母（耐高糖高活性干酵母）、高酒酵母（福邦酿酒干酵母）、布拉迪酵母（可利贝健抗腹泻专用干酵母）、畜禽酵母（畜禽专用干酵母）、反刍酵母（反刍专用干酵母）均由湖北宜昌安琪酵母股份有限公司提供。

1.1.2 培养基 琼脂培养基、YPD培养基均为国产。

1.1.3 试剂 钠标准溶液、钾标准溶液、硝酸、氯化铯、乳酸、牛胆盐等均为国产。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母菌菌液的培养 取适量制备好的酵母菌悬液，用紫外分光光度计以无菌液体YPD为对照测其吸光度，调节菌液浓度OD600=0.8±0.02。

1.2.2 酵母菌酸胁迫耐受性

1.2.2.1 不同pH环境酵母菌生长情况 在灭好菌的液体YPD培养基中加入适量乳酸 （85.0%～90.0%）调节其 pH 分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0（空白组），分别取1 mL调节好浓度的菌液接种于不同pH液体YPD培养基中，摇床培养，利用分光光度计法，每隔2 h测定其在波长600 nm下的吸光值，至24 h，观察酵母菌种在各pH下的生长情况。

1.2.2.2 酵母培养液中Na+、K+浓度测定 取制备好的酿酒酵母发酵液5 mL，经3000 r/min离心10 min，取上清液再用定量滤纸过滤后（约为4 mL），作为原样品液低温贮存。加热消化，直至无色透明为止。加入适量水加热去除多余的硝酸。待烧杯液体接近2～3 mL时，冷却，用去离子水洗并转移到10 mL刻度试管中，加水定容至刻度。取适量质量浓度为1000 mg/L的Na+、K+标准储备液，配制标准系列使用液，浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL。 将消化样液、试剂空白液、标准稀释液分别导入火焰，测其发射强度。样品中元素含量计算公式：

式中：x为试样中元素的含量，mg/100 g；c为测定用试样液中元素的浓度，μg/mL；c0为试剂空白液中元素的浓度，μg/mL；V为试样液定容体积，mL；f为试样液稀释倍数；m为试样的质量，g。

1.2.3 酵母菌胆酸盐耐受性

1.2.3.1 不同胆酸盐浓度环境酵母菌生长情况取适量制备好的菌悬液，在600 nm波长处用液体YPD培养基调节其OD值为0.8±0.02，在胆盐浓度为 0%、0.30%、0.60%（牛胆盐，Solarbio，中国）的液体YPD中培养24 h后，参考国标GB4789.15-2010，计数cfu/mL计算其存活率，平行3组。计算公式为：

1.2.3.2 酵母细胞内海藻糖含量测定 精确称取鲜酵母0.1000 g（精确至0.0002 g）于离心管中，加入4.0 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液于振荡器振荡混匀后置于带有冰块的冰水中，每15 min振荡一次，共1 h，于离心机3000 r/min离心5 min，将上清液倒入50 mL容量瓶中，用冰水洗涤离心管及沉淀，振荡混匀后，再放入高速离心机中设定转速和时间3000 r/min离心5 min，将上清液倒入50 mL容量瓶中，然后用冰水稀释至刻度，摇匀。

式中：X为试样中海藻糖的百分含量，%；E为试样的吸光度；6.29为当E=1时，每毫升溶液中含海藻糖的质量，mg；W为试样质量，g；Ds为试样干物质的百分含量，%。

1.2.4 不同酵母菌株产气特性 采用Risograph酵母活性测定仪测定不同酵母不同发酵时间产气量。称取 （50±0.2）g样品放入特定的量壳体里面，温度30℃，时间12 h，酵母活性测量仪内置微处理器含有一个精准的采样时钟和输出缓冲器，保证测定结果的可靠性和精确度。RisoSmart软件给出发酵能力电子数表和曲线，进而分析和报告结果。

2 结果与分析

2.1 不同酵母菌种酸胁迫耐受性

2.1.1 不同pH环境培养酵母菌的生长曲线 通过低pH冲击试验，采用紫外分光光度计测定酵母在不同pH环境下的生长情况，从图1可以看出，6株不同酵母均可在低酸性环境中生长，且在不同pH环境中的存活率随pH下降而降低。其中，布拉迪酵母、反刍酵母和畜禽酵母3种酵母菌株在较低pH环境中的存活率均高于其余3种。由此可知，不同的pH环境对酵母菌的生长有非常显著的影响，且不同酵母菌株对环境酸胁迫耐受性有显著差异。

2.1.2 酵母培养液中Na+、K+浓度 从图2可以看出，6种酵母培养液，Na+和K+的浓度均随pH的降低而降低。有研究表明，Na+在生物膜上具有运输特性，即同向运输和反向运输同时进行，其浓度变化在细胞内呈动态平衡（张国顺等，2004；Isreal于50 mL容量瓶中加入4.0 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液，用冰水稀释至刻度，摇匀，作为空白溶液。吸取空白及样品1.00 mL于两个洁净干燥的试管中，再分别精确加入蒽酮试液5 mL，振荡摇匀，沸水浴中反应时间为10 min，拿出立即将样液温度冷却至室温，再次摇匀，放于分光光度计630 nm处，用1 cm比色皿测定吸光度，以空白作对照。试验样品中海藻糖积累量的计算公式如下：等，1993），试验中，Na+浓度明显降低可能是由于酵母细胞处于高酸性环境中时活菌数减少导致其从胞内释放到环境中的Na+减少。K+浓度的降低表明，酵母细胞在处于高酸性环境中时确实有大量K+进入细胞，维持胞内酸碱环境的稳定，从而使得酵母细胞可以在高酸性的恶劣环境中存活。试验结果显示，反刍酵母、布拉迪酵母和畜禽酵母3株试验用酵母菌株培养液中Na+浓度相对较高，而K+浓度相对较低，说明这3株酵母菌株的酸胁迫耐受性较其余几株酸胁迫耐受性强，此结果与6株试验用酵母菌株的生长曲线结果一致。

图1 6种酵母菌株在不同pH环境中培养生长情况

图2 6种酵母在不同p H环境培养24 h后培养液中金属离子浓度变化

2.2 不同酵母菌株胆酸盐耐受性

2.2.1 不同胆酸盐浓度环境培养酵母菌的生长曲线 通过胆酸盐耐受性试验，用紫外分光光度计测定酵母菌在不同胆酸盐浓度环境中的生长情况。从图3可以看出，6株不同酵母菌株均可在高浓度胆酸盐环境中生长，且呈现相同的生长趋势。在未加入胆酸盐的培养基中，6株酵母菌株均在培养6 h时出现快速增长，到12 h后趋于平稳，进入稳定期。在胆酸盐浓度为0.3%的培养基中，培养0～6 h时OD600呈下降趋势，说明有大量菌体死亡；之后开始增加。在胆酸盐浓度为0.6%的培养基中，培养到10 h时OD600才开始增加，说明随着胆酸盐浓度的增加，酵母菌体受到的损害越大。其中，布拉迪酵母、反刍酵母和畜禽酵母3种酵母菌株在较高胆酸盐浓度环境中的存活率均高于其余3株，说明其胆酸盐耐受性较其余酵母菌株更佳。

图3 6种酵母菌株在不同胆酸盐浓环境中培养生长情况

2.2.2 酵母菌细胞胞内海藻糖积累量 从图4中可以看出，6种酵母胞内海藻糖积累量随胆酸盐浓度的增加而降低，这可能是由于酵母细胞处于高浓度胆酸盐环境中时其细胞结构受到损害，部分细胞死亡所致。6株供试酵母菌胞内海藻糖含量由高到低排列的顺序为：反刍酵母、布拉迪酵母、畜禽酵母、高酒酵母、耐高糖酵母、无糖酵母，此结果与其生长曲线结果一致，说明反刍酵母、布拉迪酵母、畜禽酵母较其余用途酵母菌株胆酸盐耐受性更佳。

2.3 不同酵母菌株的产气特性 作为一株优良的饲用酵母菌株，尤其是反刍动物专用饲用酵母菌株，其应具备产气量小、发酵稳定的特点（Hofmann等，2008）。从图5中可以看出，6株不同酵母菌株均可持续稳定的发酵，并产生一定量的气体。其中，无糖酵母和高糖酵母两种酵母产气量最高，畜禽酵母和布拉迪酵母次之，反刍酵母和高酒酵母最低。

图4 6种酵母在不同胆酸盐浓度培养24 h后胞内海藻糖积累量

图5 6株不同用途酵母菌株总产气情况

3 讨论

不同用途的酵母菌株需具备不同的特性，作为一株优良的饲用酵母菌株，其必须可耐受动物消化道内的低pH和高浓度胆酸盐环境，在通过动物的胃部到达消化道内时具有良好的活性（Didari等，2014）。本试验通过对供试的6种不同用途的酵母菌株进行环境抗逆性比较，并对其机理进行初步探究。6株酵母菌株均可在较低pH环境和较高浓度的胆酸盐环境中生长，但不同用途酵母菌株对环境酸胁迫耐受性及胆酸盐耐受性表现出显著差异，供试6株酵母菌株中，作为饲用酵母菌株使用的3株酵母菌株，即布拉迪酵母、反刍酵母和畜禽酵母表现出较强的酸胁迫耐受性和胆酸盐耐受性。且其细胞内金属离子Na+和K+浓度及胞内海藻糖积累量均与其相对应的环境耐受性表现出一致的变化趋势，说明当酵母细胞处于较为恶劣的生长环境中时，其细胞内的一些物质会做出相应的应激反应保护其细胞免受损害而存活。

不同用途的酵母菌株的产气能力存在差异，发酵面食专用酵母菌株如高糖酵母，应具有较好的产气能力（苏东海，2008），而饲用酵母若产气能力好产气量大，在动物进食后其进入动物消化道内会引起动物腹胀，如可能会引起反刍动物的瘤胃膨气（王山宏等，2006），因此，饲用酵母应具备产气量小的特点，尤其是反刍动物专用饲用酵母菌株。本试验分析了6种不同用途的酵母菌株的产气特性。其中，反刍酵母产气能力最差，无糖酵母与高糖酵母产气能力相对较好。

4 结论

不同用途的酵母菌株的环境耐受性及产气能力存在差异，不同菌株的酸胁迫耐受性与其细胞内Na+、K+浓度变化有密切关系，胆酸盐耐受性与其胞内海藻糖积累量密切相关。研究试验菌株中布拉迪酵母、反刍酵母和畜禽酵母3株酵母菌株的酸胁迫耐受性和胆酸盐耐受性较其余3株酵母菌株强，且6株供试酵母菌中，反刍酵母、畜禽酵母和布拉迪酵母的产气能力均在中等产气能力以下，故此3种酵母菌株适合作为饲用酵母益生菌株使用。