益气活血化瘀汤对膜性肾病大鼠肾脏组织Podocin表达的影响*

陈玲玲 左 扬 冯 源 程锦国△

（1.浙江中医药大学附属温州市中医院，浙江 温州 325000；2.温州医科大学，浙江 温州325000）

膜性肾病（MN）是成人肾病综合征的主要病因［1］，临床上主要表现为蛋白尿或者肾病综合征。近年来其发病率逐渐上升，成为继IgA肾病后我国慢性肾脏病病理类型的又一大构成，并且年轻人的发病率在不断增高［2-3］。膜性肾病的病理表现多为肾小球基底膜（GBM）增厚以及上皮下免疫复合物的沉积［4-5］。现代医学治疗膜性肾病采用免疫抑制剂、糖皮质激素联合细胞毒类药物以及利妥昔单抗［6-7］等治疗，存在治疗费用昂贵，副作用大，疗效欠佳等问题。近年来中医学在膜性肾病的治疗及延缓其进展方面的研究也取得了较多的成果。益气活血化瘀汤是程锦国教授在中医理论指导下制定的自拟方，具有益气升阳、活血化瘀、清热燥湿的功效，在临床上治疗膜性肾病有较好的疗效。本研究旨通过被动性Heymann肾炎大鼠模型［8］，观察益气活血化瘀汤对膜性肾病的影响及可能机制，为临床防治膜性肾病寻找新的途径和干预靶点以及提供实验材料支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性健康SD成年大鼠36只，体质量（150±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2015-0009，饲养于温州医科大学SPF级动物房。饲养温度维持在20℃，分笼饲养，标准动物干饲料喂养，自由进水。

1.2 试药与仪器 益气活血化瘀汤（组成：黄芪30 g，炒白术 20 g，党参 20 g，茯苓 30 g，当归 12 g，陈皮12 g，忍冬藤 30 g，泽泻 30 g，漏芦 30 g，菝葜 20 g，黄柏10 g，天龙1 g）经常规煎煮、过滤、水浴蒸发等步骤，浓缩至生药含量分别为 2.083、4.166、8.332 g/mL规格，由浙江中医药大学饮片厂炮制中心提供；洛丁新片（盐酸贝那普利片，北京诺华制药有限公司，批号：X2342）。 抗 Fx1A 抗血清 （25 mL，PTX-002S，Probetex）、抗 Podocin 抗体（100μL，ab181143，abcam）、FITC标记抗大鼠 IgG（100 μL，WD-0294R，达文生物）、C3抗体 （200 μg，sc-28294，Santa Cuz）、AF488 标记抗鼠二抗（100 μL，DW-GAM4881，达文生物）、DAB 显色试剂盒、超敏二步法免疫组化检测试剂盒 （ZLI-9018，PV-6001，北京中杉金桥公司）。光学显微镜、病理切片机（德国Leica公司）；微量加样枪（德国Eppendorf公司）；全自动生化分析仪 （美国Beckman公司Coulter AU5800）。

1.3 造模与分组 雄性SPF级SD大鼠36只，适应性喂养1周并检测24 h尿蛋白定量均小于10 mg后开始造模。将实验大鼠随机分为空白对照组6只及造模组30只。造模组大鼠给予一次性尾静脉注射抗Fx1A血清0.6 mL/100 g体质量，空白对照组大鼠给予一次性尾静脉注射0.9%氯化钠注射液0.6 mL/100 g体质量，7 d后检测24 h尿蛋白定量＞10 mg则为模型建立成功。造模成功的大鼠随机均分为5组，即模型组、洛丁新组、益气活血化瘀汤低、中、高剂量组，每组6只。造模过程中死亡的大鼠给予随机补充，使每组均保持在6只。

1.4 干预方法 造模成功后即造模后第7天开始灌胃。正常对照组、模型组给予0.9%氯化钠注射液10 mL/kg体质量；洛丁新组给予洛丁新片0.8 mg/kg（0.8 mg/mL）体质量；益气活血化瘀汤的给药剂量为10 mL/kg体质量，其高、中、低剂量分别按照体质量为60 kg的成人每日生药量的20、10、5倍（灌胃生药含量分别为8.332、4.166、2.083 g/mL的浓缩液）计算。各组均给药4周。

1.5 标本采集与检测 分别用代谢笼收集造模后第7、14、21、28、35 天的 24 h 尿液，记录尿量，离心沉淀后去上层清液检测24 h尿蛋白定量。在造模第35天处死大鼠，采用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，用采血针心脏取血，3500 r/min、5 min离心后取上层血清用于检测生化指标。摘取大鼠两边肾脏，去掉包膜，分切肾组织，分别置于4%多聚甲醛溶液中室温固定，用0.9%氯化钠注射液浸湿的纱布包裹，-20℃冻存，剩余肾脏组织置于液氮中速冻保存。1）血尿生化检测：将收集的24 h尿液采用免疫比浊法测24 h尿蛋白定量；心脏取血收集的血液送检至温州市中医院检验科，检测血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、血清总蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、三酰甘油（TAG）。2）肾脏组织病理学检测：肾脏组织用4%多聚甲醛溶液室温固定24 h，经常规脱水、透明、浸蜡、包埋制成蜡块后切片成3 μm石蜡切片，按常规方法进行HE、Masson、PASM染色，光镜下观察肾脏组织病理学改变。3）免疫组化检测：石蜡切片后常规脱蜡至水，过氧化氢室温浸泡10 min后蒸馏水洗，高温高压抗原修复，冷却至室温后PBS洗3次，每次 5 min，滴加一抗，抗 Podocin 抗体（1∶500）4 ℃过夜。超敏二步法免疫组化检测法，滴加二抗，室温孵育 20 min，PBS洗 3次，每次 5 min，DAB 显色 3.5 min，自来水冲洗、苏木素复染、盐酸酒精分化、水洗返蓝、脱水、透明、封片。400倍光镜下观察，每张切片随机取上、下、左、右、中5个不重叠视野，拍照；采用Image Pro Plus 6.0软件对采集的图像进行累积光密度值（IOD值）进行分析，用以检测Podocin抗体的表达量。4）免疫荧光检测：大鼠肾脏组织切片至4 μm冰冻切片，PBS浸洗 20 min，滴加一抗，37℃孵育 2 h，PBS洗3次，各5 min，其中IgG为直接免疫荧光抗体，直接滴加甘油封片；滴加二抗，37℃孵育2 h，PBS洗3次，各5 min，封片。荧光显微镜下观察IgG和C3的沉积情况。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差法（LSD），方差不齐时采用Dunnett T3检验。P＜0.05或P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 动物一般情况 正常对照组大鼠状态良好，活泼好动，毛发光滑，进食正常。造模组大鼠出现不同程度的精神萎靡，毛发光泽度减弱，毛发脱落，进食减少。

2.2 各组大鼠24 h尿蛋白定量和血生化指标改变见表1～表2。造模7 d后，模型组、洛丁新组及益气活血化瘀汤各剂量组的24 h蛋白尿定量明显高于正常对照组（P＜0.05）。造模21 d后，洛丁新组及益气活血化瘀汤各剂量组的24 h蛋白尿定量开始减少。造模35 d后洛丁新组及益气活血化瘀汤各剂量组的24 h蛋白尿定量明显低于模型组（P＜0.05），益气活血化瘀汤各剂量组24 h蛋白尿低于洛丁新组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。益气活血化瘀汤低、中、高剂量组之间比较，24 h尿蛋白定量差异无统计学意义 （P＞0.05）。各组大鼠的生化水平比较，造模后，大鼠TP、ALB较正常组降低，洛丁新组及益气活血化瘀汤各剂量组较模型组升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；其余生化指标水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠24 h蛋白尿定量比较（mg，±s）

表1 各组大鼠24 h蛋白尿定量比较（mg，±s）

与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同

组 别 n正常对照组 6模型组 6洛丁新组 6 2 8 d 3 5 d 1 2.1 3±2.1 8 1 1.5 7±1.6 8 5 2.8 4±1 1.7 0* 5 4.0 5±8.5 7*4 3.0 9±8.7 0* 3 6.9 7±6.5 4*△益气活血化瘀汤低剂量组 6 2.7 5±1.3 7 5 3.0 4±2 2.2 2* 5 1.0 1±1 5.5 1* 4 0.5 7±1 0.6 3* 3 5.0 1±8.8 3* 3 0.0 3±5.5 4*△益气活血化瘀汤中剂量组 6 2.4 8±1.3 7 5 5.9 5±1 6.6 1* 5 6.0 9±1 4.0 1* 3 8.8 3±9.3 7* 3 2.1 8±9.0 3* 2 8.0 6±9.2 4△益气活血化瘀汤高剂量组 6 2.8 8±1.0 4 5 3.8 6±1 6.5 5* 5 3.8 7±1 7.9 0* 3 8.7 3±6.9 6* 3 1.6 0±3.8 1* 2 9.8 2±2.9 7*△0 d 7 d 1 4 d 3.6 2±1.5 2 4.6 9±2.1 1 9.4 9±4.4 5 2.5 4±1.1 4 6 5.7 3±2 9.9 6* 7 3.9 1±3 3.7 8*2.3 6±0.5 6 6 4.2 4±2 7.5 6* 6 7.4 2±2 6.4 8*2 1 d 1 4.5 2±3.3 7 6 4.9 8±2 3.9 1*6 0.2 9±1 9.1 0*

表2 各组大鼠生化水平比较（±s）

表2 各组大鼠生化水平比较（±s）

?组 别 n正常对照组 6模型组 6洛丁新组 6 T C（m m o l/L）1.6 1±0.2 0 1.8 1±0.4 6 2.1 2±0.3 9益气活血化瘀汤低剂量组 6 5 5.6 5±2.1 2 3 6.5 0±1.7 0 3 0.1 7±5.5 3 5.9 0±0.9 0 1.8 7±0.3 0益气活血化瘀汤中剂量组 6 5 4.4 0±2.2 0 3 6.2 8±1.1 2 3 0.5 0±6.1 9 6.2 1±0.9 7 1.8 6±0.7 3益气活血化瘀汤高剂量组 6 5 5.4 2±2.3 0 3 6.8 3±2.0 7 2 8.0 0±6.3 2 5.6 7±1.2 6 1.8 7±0.5 6 T P（g/L） A L B（g/L） S c r（μ m o l/L）5 5.5 0±1.2 2 3 7.9 5±2.6 2 3 0.3 3±1 1.1 3 5 3.5 3±3.1 0 3 5.5 3±2.5 2 2 8.8 3±5.9 8 5 3.8 3±1.7 8 3 6.7 3±2.7 7 3 0.3 3±9.1 4 B u n（m m o l/L）5.7 2±1.6 3 5.7 5±1.1 1 6.1 1±1.1 2 H D L-C（m m o l/L） T A G（m m o l/L）0.5 6±0.0 5 0.3 5±0.1 5 0.5 8±0.0 8 0.3 5±0.0 8 0.6 8±0.0 3 0.3 9±0.1 6 0.6 4±0.1 3 0.3 3±0.1 3 0.6 4±0.1 5 0.3 4±0.1 6 0.6 1±0.1 2 0.2 8±0.0 7

2.3 各组大鼠肾脏组织病理改变 见图1～图3。HE染色结果显示，正常对照组肾组织未见明显的病理学改变；造模组肾小球体积增大，肾小球毛细血管壁有不同程度的增厚，血管腔开放良好，系膜细胞及系膜基质增生。Masson染色结果显示，造模组肾小球上皮下有大量嗜复红蛋白沉积；PASM染色结果显示，造模组肾小球毛细血管壁增厚，部分肾小球基底膜增厚，内皮细胞增生，上皮下有“钉突”形成，部分小管内皮细胞脱落，刷状缘消失。

图1 各组大鼠肾脏组织病理学改变（HE染色，400倍）

2.4 各组大鼠肾脏组织免疫荧光IgG和C3沉积情况见图4～图5。正常对照组显示IgG和C3均为阴性；模型组及洛丁新组、益气活血化瘀汤各剂量组显示IgG和C3均沿肾小球毛细血管壁呈细颗粒状沉积；IgG免疫荧光结果显示，模型组及洛丁新组的荧光强度为（+++～++++），益气活血化瘀汤各剂量组的荧光强度为（+～++），其中低剂量组及中剂量组的荧光强度较高剂量组弱。C3免疫荧光结果显示，模型组及益气活血化瘀汤各剂量组的荧光强度为（++～+++），较模型组弱，益气活血化瘀汤各剂量组之间无明显差异，洛丁新组荧光强度为（+）。

图2 各组大鼠肾脏组织病理学改变（Masson染色，400倍）

图3 各组大鼠肾脏组织病理学改变（PASM染色，400倍）

图4 各组大鼠肾组织免疫荧光C3沉积情况（400倍）

2.5 各组大鼠肾脏组织Podocin阳性表达情况比较见图6，表3。与正常对照组比较，模型组Podocin表达明显减少（P＜0.01）。与模型组比较，洛丁新组及益气活血化瘀汤各剂量组Podocin表达都较模型组升高，其中益气活血化瘀汤各剂量组较洛丁新组升高明显（P＜0.01），益气活血化瘀汤各剂量组之间的差异无统计学意义。

表3 各组大鼠肾脏组织Podocin表达情况比较（±s）

表3 各组大鼠肾脏组织Podocin表达情况比较（±s）

与洛丁新组比较，＃P＜0.01

?组 别正常对照组模型组洛丁新组P o d o c i n I O D 1 2 7 0 4.1 8±4 1 1 0.3 6△3 9 6 2.8 9±2 4 4 8.3 0*6 3 6 2.6 7±6 0 0 1.4 8*益气活血化瘀汤低剂量组 1 2 4 2 6.0 0±3 4 5 2.8 4△＃益气活血化瘀汤中剂量组 1 2 2 9 2.6 7±3 7 7 4.4 5△＃益气活血化瘀汤高剂量组 1 6 0 5 2.6 2±7 5 9 4.2 9△＃

图6 各组大鼠肾脏组织免疫组化Podocin表达情况（400倍）

3 讨 论

膜性肾病临床多表现为蛋白尿，而蛋白尿持续性增加作为肾损伤标志，对肾脏疾病的治疗和预后判断有具有指导意义［9］。近年来，许多研究表明蛋白尿的产生与肾小球滤过屏障有着密切的关系，而足细胞裂孔膜（SD）作为肾小球滤过屏障的重要组成部分［10-11］，与蛋白尿的产生息息相关［12］，是近年来的一大研究热点。Podocin是足细胞裂孔膜的重要组成部分之一，它以发夹样结构插入足突膜，与Nephrin及CD2AP等其他蛋白配合作用，共同维持裂孔膜构造和功能的完整性［13-14］。有研究表明［15］，在 Heymann 早期免疫荧光染色显示Podocin已经从现状变成粒状，Podocin的表达减少以及它与Nephrin的分离可能促进了蛋白尿在膜性肾病中的发展；Podocin在特发性膜性肾病和继发性膜性肾病中均表达减少，其表达改变可能是导致肾小球滤过屏障受损，产生大量蛋白尿的直接原因［16］。以上都说明了膜性肾病蛋白尿的产生可能与肾脏组织Podocin蛋白的表达减少有关。

中医学古籍中并无膜性肾病的记载，根据其临床特征可大致归属于中医学的“水肿”“尿浊”“腰痛”等病证范畴。许多医家认为，膜性肾病的病机特点是本虚标实，本虚主要是脾肾两虚，标实是湿热、水湿、瘀血等［17-18］。益气活血化瘀汤为本文通信作者程锦国教授的自拟方，程锦国教授认为膜性肾病多系肺、脾、肾虚损，水液及气血运行失常，引起水湿、湿热、浊毒等壅结于内，进一步导致瘀血内停，精微外泄［19］。方中黄芪、党参补气升阳、健脾益肺为君，白术、茯苓健脾渗湿，当归养血补血活血，使活血而血不妄行，散瘀而正气不损，陈皮理气燥痰化湿为臣药，忍冬藤、泽泻、漏芦、黄柏清热解毒燥湿，天龙活络散结，使气行则血行。诸药合用共奏益气升阳、活血化瘀、清热燥湿之功。

本实验研究结果表明，益气活血化瘀汤可以上调膜性肾病大鼠Podocin蛋白的表达，减少膜性肾病大鼠蛋白尿的产生，在一定程度上维持足细胞结构的正常以及肾小球滤过屏障功能的完整性，从而达到保护肾脏功能，延缓肾脏病理改变。这可能是益气活血化瘀汤对膜性肾病的作用机制之一，其对足细胞以及肾小球滤过屏障功能的其他作用机制仍需要进一步探索。