小尾寒羊FSHR基因在生殖轴的表达研究

2018-11-30寸静宇刘秋月王翔宇胡文萍张效生张金龙赵永聚储明星

中国草食动物科学 2018年6期

寸静宇，刘秋月，王翔宇，狄冉，胡文萍，张效生，张金龙，赵永聚，储明星

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.西南大学动物科技学院，重庆 400715；3.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381）

多羔性状是影响绵羊养殖业的重要经济性状之一，所以提高每胎的产羔数是提升羊生产经济效益的重要措施［1］。而绵羊多羔性状候选基因的研究对于提高绵羊产羔性状具有重要意义［2］。随着科技进步及许多与绵羊多羔性状相关的候选基因的陆续发现［3］，在生产中利用分子标记对绵羊多羔性状的基因型选择取得了很大进展。

促卵泡激素（Follicle-stimulating hormone，FSH）属于糖蛋白类促性腺激素，是控制哺乳动物生殖的核心激素，由垂体合成分泌并通过外周血液循环作用于其卵巢中的受体（FSHR）来调控个体繁殖过程［4］。FSHR主要表达于卵巢颗粒细胞中，其表达水平与颗粒细胞的分化、卵泡闭锁及成熟密切相关［5］。朱吉等［6］研究发现，在贵州黑山羊中，FSHR基因的表达水平对产羔数的影响达到了显著水平（P＜0.05），由此推断，FSHR基因可能是影响山羊产羔数的候选基因。胡亮等［7］研究发现，在多羔的金堂黑山羊卵巢中，FSHR基因mRNA的表达水平高于单羔的藏山羊（P＞0.05），金堂黑山羊的卵泡对FSH的敏感性高，这可能也是影响山羊高排卵数的重要机制。

鉴于此，本试验在小尾寒羊群体中，使用Taqman探针法对FecB基因进行分型，经过连续观察并记录产羔数和黄体数（产羔数和黄体数均大于或等于2，则定义为多羔），确定了小尾寒羊FecB基因突变++型中产单羔和产多羔的个体，并以此为研究对象，使用实时荧光定量PCR技术，检测FSHR基因在生殖轴相关组织中的表达情况，以探讨FSHR基因表达与小尾寒羊（STH）产羔数之间的关系，为小尾寒羊多羔性状的机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验样品及主要试剂

随机选取3周岁健康状况良好的小尾寒羊母羊6只（FecB++型单羔和多羔各3只），饲养于天津市畜牧兽医研究所试验羊场。用孕酮阴道栓（CIDR）对6只小尾寒羊进行处理，12 d后撤栓，在撤栓后45 h屠宰并立即采集大脑、小脑、下丘脑、卵巢、子宫、输卵管、垂体7种组织，液氮中保存，转移到-80℃冰箱保存备用。

RNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司（北京），反转录试剂盒（PrimeScriptTMRTReagent Kit）和荧光定量染料（SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ）均购于TaKaRa公司（大连）。

1.2 RNA提取

用Trizol和RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）提取上述组织总RNA。利用Nanodrop 2000检测所提取的总RNA浓度和OD值，并用1.5%的琼脂糖凝胶对RNA进行电泳检测，置于-80℃冷冻备用。

1.3 cDNA合成

利用反转录试剂盒反转录合成cDNA，反转录体系总体积为20 μL，具体见表1。反转录反应条件为：37℃15 min，85℃5 s，获得cDNA第一链。全程在冰上操作。反转录产物进行5倍稀释，用持家基因β-actin进行PCR检测，可成功扩增。将符合标准的cDNA置于-20℃保存，以用于检测目的基因的表达。

表1 反转录体系

1.4 定量引物设计

根据GenBank提供的绵羊FSHR基因mRNA序列（登录号为：NM_001009289.1），利用 Primer Premier 6.0软件进行跨外显子引物设计，以β-actin（NM_001009784.2）作为内参基因。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。引物名称和序列以及扩增片段大小见表2。

表2 荧光定量引物信息

1.5 实时荧光定量PCR

荧光定量检测采用Roche Light Cycler®480Ⅱ型荧光定量PCR仪，以β-actin基因为内参基因，每个样品重复检测3次。反应体系总体积为20 μL，具体见表3。PCR 程序为：95℃预变性 5 s，95℃变性 10 s，60℃ 30 s，40个循环；反应结束后对熔解曲线进行分析。

表3 实时荧光定量PCR体系

1.6 统计分析

荧光定量结果采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，数据差异显著性用SPSS 19.0进行统计学分析，组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），用最小显著差异法（Least significant difference，LSD）进行多重比较，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取与cDNA合成

使用动物组织总RNA提取试剂盒提取小尾寒羊各组织的RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，电泳条带明亮清晰、整齐、无拖尾；以反转录之后的cDNA为模板对β-actin进行RT-PCR扩增，设计的β-actin引物扩增效果良好（图1），目的片段与预期的97 bp一致，且条带单一，可以用于后续的荧光定量试验。

图1 cDNA电泳检测

2.2 绵羊FSHR基因在小尾寒羊（多羔和单羔）繁殖相关组织中的表达

利用荧光定量PCR技术对FSHR基因在大脑、小脑、下丘脑、卵巢、子宫、输卵管和垂体组织中的表达水平进行了研究，结果见图2。结果显示：FSHR基因主要集中在卵巢、大脑、垂体组织中表达。FSHR基因在小尾寒羊多羔群体卵巢和垂体组织中的表达量均极显著高于小尾寒羊单羔群体（P＜0.01）。

图2 FSHR基因在小尾寒羊繁殖相关组织中的表达

3 讨论

在人类和动物的生殖活动中，FSHR是重要的媒介［8］。FSHR主要表达于卵巢颗粒细胞中，其表达水平与颗粒细胞的分化、卵泡闭锁及成熟密切相关。近年来，国内外学者围绕绵羊［4］、母马［9］和猫［10］等动物的卵巢中FSHRmRNA表达方面做了大量研究。然而，FSHR除了在卵巢中表达外，研究者也发现在非性腺组织中表达。本研究对小尾寒羊下丘脑-垂体-卵巢轴相关组织FSHR表达进行了定量检测，结果发现，FSHR在小尾寒羊中主要集中在卵巢、大脑、垂体组织中表达，其中在卵巢高表达，这与前人的研究结果相一致。龙威海等［11］研究发现，FSHR在黔北麻羊、贵州白山羊和贵州黑山羊下丘脑、垂体、子宫、输卵管和卵巢5种组织中均有表达；Huo等［12］的研究发现，在发情期的牦牛，FSHR主要在垂体和卵巢中表达。而本研究发现，FSHR只在小尾寒羊的卵巢、大脑和垂体3种组织中表达，推测可能是因为物种差异。另外，Chen等［13］通过蛋白检测发现，FSHR在牦牛的子宫环肌层、上皮细胞和固有层中表达，在输卵管的粘膜皱襞中表达，在卵巢的颗粒层表达，所以本研究与前人研究的差异也可能是因为在试验前期的采样过程中，并未采集到基因在组织中高表达的部位。本研究中，产多羔的小尾寒羊FSHR在卵巢和垂体的表达量极显著高于产单羔的小尾寒羊（P＜0.01），这与Goyal等［14］和龙威海等［11］的研究结果相一致，推测小尾寒羊的繁殖性能受到FSHR的调控，FSHR在繁殖相关组织的基因表达量可能与绵羊产多羔性状有关。