策勒黑羊发情周期不同阶段卵巢LNC-010801和LNC-008562表达规律的研究
2018-11-30邵焱焱米热尼沙库尔班闫梦阳闫雪琪范庆祥袁晓峰曾献存
邵焱焱 ，米热尼沙·库尔班 ，闫梦阳 ，闫雪琪 ，范庆祥 ，袁晓峰 ，曾献存
（1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000；2.新疆和田市策勒县畜牧兽医工作站，和田 848000）
长链非编码RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA。有研究表明，LncRNA在表观遗传调控、转录和转录后调控等不同层次上均可调控基因表达水平，而且在细胞分化、细胞周期调控、生长发育、基因组印记和配子生成等许多生命过程中发挥着极其重要的作用［1-3］。
策勒黑羊是我国特色新疆绵羊，主要集中在新疆和田地区，由于特殊的生态环境，具有耐粗饲、耐寒、抵抗力强、性成熟早、常年发情和繁殖率高等特点。策勒黑羊平均产羔率达215.46%，产后20～30 d便可发情，目前大部分牧区已实行一年两产或两年三产模式。因此，充分开发利用策勒黑羊优良性能和多胎性，对新疆绵羊的长久发展具有重要意义［4-5］。LNC-010801和LNC-0085622个LncRNA是项目组前期通过策勒黑羊卵巢组织转录组测序的，本研究以策勒黑羊为实验材料，检测LNC-010801和LNC-008562在策勒黑羊发情周期不同阶段卵巢组织中的表达水平，为后续研究LncRNA参与策勒黑羊繁殖性状的调控作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物与样品采集
参考产羔记录，在大群体中选择3～4岁策勒黑羊（多胎个体）15～20只。于早晚放入试情公羊，结合外阴检查和阴道检查，判断羊只是否发情。母羊第一次有发情表现时到下次发情的间隔时间即为1个发情周期。在下次发情周期的发情前期、发情期、发情后期、发情间期4个不同阶段，分别屠宰策勒黑羊3只，采集卵巢组织，立即置于液氮中保存用于后续分析。
1.2 主要试剂与仪器
Trizol试剂盒，反转录试剂盒，Takara-RR820A，荧光定量管，DD水，枪头，荧光定量PCR仪。
1.3 方法
1.3.1 卵巢组织总RNA的提取 按TRIzol提取试剂盒操作说明，提取发情周期不同阶段卵巢组织的总RNA，使用Nanodrop检测RNA的纯度，Agilent 2100及琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。经检测符合测序质量要求的各RNA样品，用于后续研究。
1.3.2 实时荧光定量检测 2个LncRNA引物见表1，引物由上海生工合成。
按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）试剂盒说明书操作进行基因组DNA去除和反转录。去除基因组DNA反应：20 μL反应体系为5×gDNA Eraser Buffr 4 μL，gDNA Eraser 2 μL，Total RNA 1 μL，补水至 20 μL，在冰上配制反应混合液，在 42 ℃2 min。反转录反应：反应体系40 μL，上述反应液20 μL，PrimeScrt RT Enzyme Mix Ⅰ 2 μL，RT Primer Mix 2 μL，5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）8 μL，补水至 40 μL，37℃ 5 min，8℃ 5 s。
表1 LNC-010801、LNC-008562及内参扩增引物
按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒（Takara）说明书操作进行Real Time PCR反应：上、下游引物各1 μL，TB Green Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，RT 反应液 2 μL。扩增程序采用两步法：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共45个循环。每个样品重复3次。
1.3.3 试验数据的统计分析 采用2-△△ct法进行相对定量分析，用统计软件SPSS 17.0进行显著性检验。
2 结果与分析
2.1 总RNA质检
对策勒黑羊卵巢组织提取的总RNA进行纯度、总量和完整性检测，结果表明，RNA质量和完整性较好，未发生明显降解，可以用于本实验。电泳检测结果见图1。
图1 琼脂糖凝胶电泳检测结果
2.2 策勒黑羊卵巢组织LNC-010801、LNC-008562 LncRNA表达水平的结果分析
标准曲线结果显示（如图2、3），在同一时期相同基因的样品中，扩增曲线平整，指数区较光滑，且重复性较好，熔解曲线平滑，峰值单一，说明LncRNA扩增有效准确。
图2 LNC-010801扩增曲线和熔解曲线
图3 LNC-008562扩增曲线和熔解曲线
2.3 策勒黑羊发情周期不同阶段卵巢组织LNC-010801、LNC-008562 LncRNA 表达量
实时定量PCR检测差异表达LncRNA结果表明（如表2），策勒黑羊不同发情周期阶段LNC-010801、LNC-008562 LncRNA在卵巢组织中均有表达，呈现动态变化趋势。LNC-010801的表达量在发情前期卵巢组织中显著高于发情期（P＜0.05）和发情后期（P＜0.05）；LNC-008562的表达量在发情期卵巢组织中极显著高于发情间期（P＜0.01）、显著高于发情前期（P＜0.05）和发情后期（P＜0.05）。
表2 发情周期不同阶段卵巢组织中LNC-010801、LNC-008562 LncRNA的表达量
3 讨论
目前，LncRNA的研究在畜禽方面已有不少报道，但在动物繁殖领域却很少被报道。研究表明，LncRNA的表达水平比mRNA低，且具有时空特异性和组织特异性。在不同组织或者不同发育阶段差异表达LncRNA的筛选已经在很多研究中被用于寻找功能性LncRNA［6-8］，LncRNA分子对哺乳动物生殖以及配子生成等方面具有重要调节作用。Caballero等［9］对牛卵母细胞以及胚胎发育早期阶段发现的3个LncRNA的表达和亚细胞定位进行了研究。LncRNA可以促进动物妊娠的建立，在小鼠体内，若去除在黄体组织中高表达的Neat1基因，可导致小鼠不能妊娠［10］。LncRNA还可以促进动物早期胚胎发育。研究者们通过研究发现，在不同胚胎发育阶段发现大量LncRNAs［11］。绵羊的繁殖性能主要受下丘脑-垂体-性腺轴的调控，其中绵羊LncRNA在性腺轴（下丘脑-垂体-卵巢-子宫）中均有表达，在基因表达调控中发挥着重要作用［1-2］。但绵羊LncRNA的研究尚处于起步阶段，其功能及调控机制还需要深入研究。研究检测发现，LNC-010801、LNC-008562在策勒黑羊发情周期各个阶段卵巢组织中的表达量不同，呈现一定的变化规律。LNC-010801在发情前期表达量达到最大值，发情期达最低；而LNC-008562在发情期表达量达到最大值，在发情间期达最低。这2个LncRNA在不同阶段的表达量不同，可能是因为这2个LncRNA在绵羊发情周期卵巢组织中起的作用不同。因此LNC-010801、LNC-008562 LncRNA是研究绵羊繁殖性状的重要候选LncRNA，为后续研究LncRNA参与策勒黑羊繁殖性状的调控作用奠定基础。
4 结论
基于实验研究，策勒黑羊卵巢组织中LNC-010801和LNC-008562在发情周期不同阶段卵巢组织中表达量有所不同，推测这2个LncRNA在绵羊发情周期卵巢组织中起不同的作用。本研究不仅丰富了绵羊非编码RNA数据，也为阐明绵羊多胎性能的分子调控机理提供分子生物学方面的理论依据。
