输精体积与精子数对德州母驴情期受孕率的影响

刘 冰 ，张瑞涛 ，李 敏 ，杨 峰 ，杨伟刚 ，于 杰 ，尹桂军 ，李雪贤 ，吴帅帅 ，

（1.国家中药工程胶类研究中心，山东 东阿 252200；2.中国农业大学，北京 100193）

近些年随着驴肉市场的不断升温，阿胶行业的持续发展，集约化、规模化的驴养殖也日益增多，驴的繁殖问题也受到越来越多的关注。在马属动物中，常见繁殖辅助技术如人工输精、定时排卵等已经在马的繁殖中得到较为普遍的应用，而关于驴人工输精的输精体积及输精剂量等方面的研究、应用报道却很少。目前，驴繁殖中的输精方法和输精剂量多借鉴于马的繁殖，如用15～25 mL 体积、20 亿～25 亿个精子数进行子宫体输精［1-3］，但越来越多的研究表明，马和驴在生理结构等方面存在较大差异［4］。已知精液作为异源物质可引起机体的免疫反应［5］。输精体积和精子数过大可引起子宫体炎症反应的同时，造成精液浪费、成本增加［6-7］，而输精体积和精子数过少又可能导致受孕率降低［7］。基于以上现状，为探究驴人工输精的最佳输精剂量，本试验从输精体积和有效精子数两方面研究其对母驴情期妊娠的影响，以期在指导驴生产的同时，为今后更深入地探讨驴优秀种质资源提供必要参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

计算机辅助精子活力分析仪（AndroVisionTM，德国米尼图minitube公司），精子密度仪（RS232，法国卡苏科技股份有限公司），恒温热台（CBI0-2000，北京赛百奥科技有限公司），电热恒温水槽（DK-8B，上海精宏实验设备有限公司），B超（KX5600，徐州凯信电子股份有限公司），输精管（法国卡苏），无橡胶塞注射器，等等。

1.2 试验动物

2017年5—7月在山东东阿国家黑毛驴繁殖中心（北纬 36°33′，东经 116°25′）随机选择 139 头年龄介于3～7岁的健康能繁德州母驴及精液品质良好的6头种公驴进行繁育试验。

1.3 B超检测母驴

母驴保定在四柱栏后，掏净直肠内的粪便。手带涂有润滑剂长臂手套，选择5.0 MHz B超机探头进入直肠，检测母驴的卵泡发育情况。根据超声波图像测量卵泡直径，当卵泡直径≥30 mm时，肌肉注射1.0 mL的GnRH缓释液，然后输精［8］。次日检测排卵情况，如无排卵进行隔日输精。记录排卵时间，并于排卵15 d后使用B超机进行妊娠诊断。

1.4 精液采集及质量检测

通过假阴道法［9］采集种公驴精液，将采集到的精液滤除凝胶部分后置于38℃预热的量筒中，读取精液体积。用精子密度仪测量精子密度，先加入3 mL生理盐水于比色皿中，归零，后于精液液面下中部取120 μL原精液加入比色皿中，混合均匀，测量密度。同时，精液液面以下中间部位取7 μL原精液置于预热的载玻片上，盖上盖玻片，置于带有38℃恒温板的显微镜下用计算机辅助精子活力分析仪（CASA；Computer-assisted sperm analysis）检测精液活力。每个样本检测5个视野，记录前进式活力和快速前进式活力。检测密度≥1.5×108个/mL，直线前进运动式活力≥0.7的精液用于以下试验。

1.4.1 试验1：一定输精体积下，输精精子数对驴情期受孕率的影响

Rota等［10］报道了驴人工冻精输精中使用INRA96作为冻精基础稀释液获得了较好的妊娠率。本试验根据采集精液密度添加相应体积的INRA96稀释液使15 mL输精体积下含有的总精子数分别为10亿、8亿和6亿个。置38℃水浴锅中待用，并在60 min内完成发情母驴子宫体输精。

1.4.2 试验2：一定精子数下，输精体积对驴情期受孕率的影响

根据采集精液密度计算6亿个直线前进精子数、添加相应体积的INRA96稀释液，使输精体积分别为10、8和6 mL。置38℃水浴锅中待用，并在60 min内完成发情母驴子宫体输精。

1.4.3 试验3：在试验1、2得出的最佳妊娠率的输精有效精子数、体积的基础上，进一步降低输精有效精子数

根据采集精液密度添加相应体积的INRA96稀释液，使10 mL输精体积下含有的总精子数分别为6亿、5亿和3亿个。置38℃水浴锅中待用，并在60 min内完成发情母驴子宫体输精。

1.5 数据统计分析

卡方检验统计分析妊娠差异。

2 结果与分析

2.1 不同有效精子数对母驴情期受孕率的影响

如图1所示，15 mL子宫体输精体积下，10亿、8亿和6亿个精子数的受孕率分别为42.86%、37.50%和40.00%，且无统计学差异（P＞0.05）。

图1 15mL子宫体输精体积、不同精子数的受孕率比较

2.2 不同输精体积对母驴情期受孕率的影响

基于2.1试验结果，选择6亿个精子数下，15、10和5 mL输精体积的受孕率分别为40.00%、38.46%和11.11%，且无统计学差异（P＞0.05）（见图 2）。

图2 6亿个精子数下不同输精体积受孕率比较

2.3 低剂量输精对母驴情期受孕率的影响

依据2.1和2.2试验结果，结合生产实际，试验在验证10 mL输精体积下，6亿个精子数输精方式的同时，进一步探究5亿个和3亿个精子数对母驴情期受孕率的影响。结果显示，6亿、5亿和3亿个精子数的受孕率分别为38.46%、25.00%和5.60%（见图3）。其中，6亿个精子数的受孕率与3亿个精子数的受孕率差异显著（P＜0.05），5亿个精子数与3亿个精子数、6亿个精子数相比受孕率无显著差异（P＞0.05）。

图3 10mL输精体积下不同精子数受孕率比较

3 讨论

公驴单次射精的总精子数为2×109～15×109个精子［11］。精子进入子宫后，会在子宫收缩、宫内液体、输精体积和精子活力等因素的共同作用下，发生精子向子宫输卵管结合处运动的选择性。研究表明，输精4 h后母马就可在输卵管建立精子库［12］，但目前对于驴精子输卵管运动特性还不清楚。有研究提出，母畜情期多次输精可对精子与雌性生殖道的相互有害影响起到“补偿性因素”的作用［13］，并可在输卵管精子库储存足够数量，但这种“补偿性因素”与母畜受胎的相关性强度还没有明确定义。基于上述原因，有学者提出可在确保一次输精后输卵管建立有效精子库的前提下，通过使用外源激素如GnRH和hCG等促进母驴排卵发生［8］，并在距离排卵最近的时间范围内输精，缩短精子与子宫内膜的相互作用时间来提高受孕率［14］。本试验依据外源激素GnRH促进驴排卵规律［8］，完成试验母驴情期内输精1次，排除了多次输精对试验的干扰。

人工干预条件下，母马子宫体人工输精通常会输入250×106～500×106个直线前进的精子。研究发现，当输精剂量在500×106个时，即使精液检测指标出现某些误差或输精条件不是很理想时，也会获得可以接受的妊娠结果。使用高繁殖力公畜精液并将输精剂量减少到100×106个也不会影响输精妊娠效果［1-3］。但当母马情期子宫体输精的输精剂量下降到20×106～60×106个时，其情期受孕率会显著下降（由75%降低到30%～40%）［15］。虽然马和驴同属于马属动物，但越来越多的研究表明两者存在差异，如各自利用其公畜一定量精子进行情期人工输精后发现，德州母驴情期妊娠率（40%左右）明显低于母马［13］。与此同时还发现，如果将母马、驴的情期输精剂量增加到1×109个时，两者情期受孕率无统计学差别［13］。这一现象也与自然条件下母马、驴高剂量精液来确保怀孕相互印证。

相比精子数对妊娠率影响来说，输精体积对妊娠影响的关注一直较少。实际生产中发现，情期使用过大体积输精会因母畜子宫颈腔打开而造成输精精液外流，同时易引起母畜子宫炎症等问题［6-7］。对母马的研究表明，10～30 mL范围内的输精体积对其情期受胎无影响［7］。本试验的结果也显示，5、10、15 mL子宫体输精后的母驴情期受孕率在各组之间无统计学差异。因此，配种人员可根据实际情况，将采集公畜精液依据密度、活力、体积，使用稀释液稀释到合适密度、体积进行子宫体输精。

在研究中，人们会依据不同的精子保存类型来选择不同的输精方式。Vazquez等［16］对10匹母马使用宫腔镜，将20 μL体积、4×106个精子沉积在子宫输卵管乳头部位上进行人工授精，最终确认3匹母马妊娠，6匹母马在输精后出现了子宫内膜炎反应。Manning等［17］将含有1×106个或10×106个马精子的0.16～0.25 mL台式液直接输入母马输卵管后的妊娠率分别为22%和30%。与Manning不同的是，Morris等［18］将鲜精离心后使用台式液稀释，并使0.03～0.15 mL台式液分别含有10×106、5×106、1×106、0.5×106、0.1×106个或 0.001×106个直线前进的精子，采用宫腔镜将精液沉积在母马子宫输卵管结合处（未到乳头）。结果发现，10×106、5×106个或 1×106个精子情期受孕率大于60%，而低于0.5×106个精子数的情期受孕率为30%。上述结果表明，直接将精子输入输卵管或绕过子宫输卵管结合处的选择性屏障不利于母驴受孕。一定输精精子数下的输精部位也会影响母畜情期受孕率。

本研究结果表明，对于繁殖季节母驴人工输精体积与精子数来说，通过情期子宫体输精10 mL、6亿个精子可在保证受孕率的同时，充分发挥优秀种公驴的繁殖潜力和利用价值。