Semaphorin 3A 早期诊断对比剂急性肾损伤的价值

张艺欣， 宁 莉， 魏殿军

（1.天津医院输血科，天津 300211；2.天津医科大学第二医院检验科，天津 300211；3.河北燕达医院检验科，河北 廊坊 065201）

对比剂急性肾损伤（contrast-induced acute kidney injury，CIAKI）是指血管内应用对比剂后3 d内出现急性肾损伤或原有肾损伤加剧，并排除其他原因导致的肾功能障碍[1]。CIAKI是心脏冠状动脉造影和经皮冠状动脉介入治疗的常见并发症。随着血管造影、增强电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）、心脏血管再通技术等一系列现代影像技术和介入治疗的不断应用和发展，CIAKI发生率也呈逐年上升的趋势，现居医院获得性急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）病因的第3位[1]。患者一旦出现CIAKI，其病死率及预后不良、终末期肾病的发生率将显著增加，同时住院时间也明显延长。因此，CIAKI的早期诊断对改善患者预后极为重要。近年来，多种具有临床应用潜力的AKI标志性蛋白逐渐被发现，如中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）、β2-微球蛋白（beta2-microglobulin，β2-MG）、胱抑素C（cystatin C，Cys C）、肾损伤分子1（kidney injury molecule 1，KIM-1）、白细胞介素18（interleukin 18，IL-18）等，但这些指标在辅助临床诊断及指导疾病治疗方面尚不成熟。因此，临床为实现CIAKI的早期发现、早期诊断和早期干预，迫切需要寻找早期的、具有较高敏感性和特异性的生物学标志物。

Semaphorin（Sema）3A是Semaphorins家族中的一种分泌型蛋白，与调节免疫功能、肿瘤发生及发展、器官形成具有密切关系[2]。Sema 3A在成年人肾脏的远曲小管上皮细胞中表达[3]，过度分泌可导致肾小球内皮细胞损伤和基底膜分层，从而引起肾脏损伤[4]。近期有研究结果显示，Sema 3A在正常成人尿中通常检测不到，但在AKI发生后可快速检出，因此Sema 3A可作为AKI的早期预测指标[5]。目前，Sema 3A对CIAKI的临床诊断价值报道甚少，国内尚无这方面的研究。本研究通过检测成人冠状动脉造影及支架植入术后并发CIAKI的患者外周血和尿液Sema 3A水平以及β2-MG、Cys C、血清肌酐（serum creatinine，SCr）早期的变化，分析Sema 3A与早期CIAKI之间的关系，寻找CIAKI最理想的早期生物学标志物。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年6月—2016年6月天津医科大学第二医院心脏内科行冠状动脉造影及支架植入术患者350例，其中男220例、女130例，年龄31～84岁。记录患者的年龄、性别、体重指数（body mass index，BMI）、血红蛋白（hemoglobin，Hb）、糖化血红蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）、空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、B型钠尿肽（B-type natriuretic peptide，BNP）、左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、SCr、β2-MG、Cys C的手术前基础值，是否合并高血压或糖尿病以及冠状动脉造影及介入手术后的住院时间、是否透析和发生死亡等情况。

CIAKI的诊断标准参照欧洲泌尿生殖放射协会（European Society of Urogenital Radiology，ESUR）2003年制定的标准[6]：与基线值相比，接触对比剂后72 h内SCr相对值升高25%或绝对值升高44.2 μmol/L（0.5 mg/dL），并除外其他可能的原因。所有患者术前肾功能均正常，基础肌酐清除率＞100 mL/（min·1.73 m2）（采用Schwartz公式计算）。为减少术后循环损耗和肾前氮质血症的影响，所有受试者应在第1次手术后24 h内补充损耗液体的80%，直至100%。根据CIAKI诊断标准将350例患者分为CIAKI组46例、非CIAKI组304例。

排除标准：碘过敏者、急慢性感染者、近期发生急性肾功能衰竭者、SCr＞300 μmol/L的慢性肾功能不全者、处于血液透析治疗中的患者、恶性肿瘤患者、最近1周接受过造影剂检查以及顺应性差者、之前服用过肾脏毒性药物和尿液收集不完整者。

1.2 样本采集与检测

收集所有患者术前及术后6、12、24、48、72 h的血液和尿液样本。采用促凝剂/分离胶黄帽真空采血管一次性抽取患者血液3～5 mL，以1 260×g离心5 min，分离血清，储存于-20 ℃冰箱。留取患者中段清洁尿10 mL，以560×g离心5 min，取上清分装。检测前将样本恢复至室温，完全融化、复温、混合均匀。

1.3 仪器与试剂

NORMAN系列散射比浊分析仪（南京诺尔曼生物技术有限公司）、BS2000M全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）。β2-MG及Cr试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，Cys C试剂盒购自北京九强生物技术股份有限公司。Sema 3A试剂盒购自天津信睿生物科技有限公司。

1.4 血清、尿液Sema 3A水平检测

采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测患者血清和尿液Sema 3A水平。严格按试剂说明书操作。为排除尿液稀释对Sema 3A水平的影响，采用尿液肌酐（urinary creatinine，UCr）矫正Sema 3A检测结果，最终结果以Sema 3A/UCr比值表示，单位为pg/μmol Cr。ELISA试剂盒的最低检出率为0.57 ng/ mL，检测范围为1.563～100.000 ng/mL，变异系数为6.8 %。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据以表示。2个组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素ANOVA分析。呈非正态分布的数据以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用秩和检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估各项目诊断CIAKI的价值。采用Spearman相关分析评估不同时间点的尿液Sema 3A水平与临床表现（SCr百分比变化、手术后住院时间和AKI持续时间）的相关性。采用Logistic回归分析评估AKI的预测因子，潜在独立预测变量包括最佳检出时间的尿液Sema 3A水平、年龄、性别、心脏手术和住院时间。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象一般临床资料比较

350例患者中有46例患者术后发生CIAKI，发生率为13.1%。住院期间CIAKI组发生死亡1例（男性）。CIAKI组性别比例、糖尿病和住院时间与非CIAKI组比较差异有统计学意义（P＜0.05），其他项目差异均无统计学意义（P＞0.05）。患者一般情况见表1。

2.2 CIAKI患者血清SCr、β2-MG、Cys C水平及血清、尿液Sema 3A水平的变化

与术前基础值比较，CIAKI组SCr、β2-MG、Cys C、血清Sema 3A水平均有不同程度的升高（P＜0.05），于术后48 h达到最高值。CIAKI组24和48 h的SCr、β2-MG、Cys C、血清Sema 3A水平明显高于非CIAKI组（P＜0.05）。CIAKI组尿液Sema 3A在手术后6 h明显升高（P＜0.05），而术后12 h后则明显降低（P＜0.05）。非CIAKI组尿液Sema 3A仅有短暂、较小幅度的升高，手术12 h后保持在基线水平。见表2～表 6、图1。

表1 研究对象一般临床资料比较

表2 CIAKI组和非CIAKI组术前及术后血清SCr的变化 （μmol/L，）

表2 CIAKI组和非CIAKI组术前及术后血清SCr的变化 （μmol/L，）

注：与非CIAKI组比较，*P＜0.05；与同组术前基础值比较，#P＜0.05

组别 例数 术前基础值 术后6 h 12 h 24 h 48 h 72 h CIAKI组 46 53.11±10.30 56.88±12.45 58.71±11.63 68.11±13.24*# 72.53±12.10*#67.11±11.04*#非CIAKI组 304 57.22±11.90 54.62±10.01 56.35±12.11 54.16±10.58 55.54±12.42 50.90±11.21

表3 CIAKI组和非CIAKI组术前及术后血清β2-MG的变化 （mg/L，）

表3 CIAKI组和非CIAKI组术前及术后血清β2-MG的变化 （mg/L，）

注：与非CIAKI组比较，*P＜0.05；与同组术前基础值比较，#P＜0.05；与同组术后6 h比较，△P＜0.05；与同组术后12 h比较，▲P＜0.05

组别 例数 术前基础值 术后6 h 12 h 24 h 48 h 72 h CIAKI组 46 1.59±0.71 1.52±0.68 1.62±0.87 1.82±0.74*# 2.13±0.50*#△▲ 1.55±0.62非CIAKI组 304 1.54±0.74 1.51±0.63 1.55±0.44 1.49±0.74 1.49±0.85 1.50±0.76

表4 CIAKI组和非CIAKI组术前及术后血清Cys C的变化 （mg/L，）

表4 CIAKI组和非CIAKI组术前及术后血清Cys C的变化 （mg/L，）

注：与非CIAKI组比较，*P＜0.05；与同组术前基础值比较，#P＜0.05

组别 例数 术前基础值 术后6 h 12 h 24 h 48 h 72 h CIAKI组 46 0.53±0.35 0.51±0.41 0.51±0.37 0.75±0.32*# 0.83±0.19*# 0.76±0.21*#非CIAKI组 304 0.57±0.51 0.56±0.23 0.49±0.31 0.58±0.45 0.54±0.11 0.57±0.33

表5 CIAKI组和非CIAKI组术前及术后血清Sema 3A的变化 [ng/mL，M（P25～P75）]

表6 CIAKI组和非CIAKI组术前及术后尿液Sema A的变化 （pg/μmol Cr，）

表6 CIAKI组和非CIAKI组术前及术后尿液Sema A的变化 （pg/μmol Cr，）

注：与非CIAKI组比较，*P＜0.05；与同组术前基础值比较，#P＜0.05

组别 例数 术前基础值 术后6 h 12 h 24 h 48 h 72 h CIAKI组 46 35.0±5.1 293.8±25.3*# 158.2±17.3*# 67.8±6.6*# 56.5±5.9 46.0±4.5非CIAKI组 304 34.8±4.3 51.9±6.5 33.9±4.5 27.1±2.4 27.9±2.3 30.2±2.5

图1 心脏造影术后患者血清、尿液Sema 3A变化

2.3 尿液Sema 3A与CIAKI的相关性分析

单因素Logistic回归分析显示男性（P=0.023 0）、住院时间较长（P=0.000 7）及术后6 h（P=0.002 5）、12 h（P=0.003 8）、24 h（P=0.008 6）的高尿Sema 3A水平与CIAKI发病相关。进一步行逐步Logistic回归分析，以年龄、性别、住院时间、尿Sema 3A最佳检测时间点（术后6 h）为变量预测CIAKI，队列模型显示性别、术后6 h 尿Sema 3A水平是独立预测CIAKI的指标。

对尿液Sema 3A与CIAKI患者临床指标进行相关性分析，术前尿液Sema 3A水平与年龄、术后SCr变化和AKI持续时间呈负相关（P＜0.05）。术后6 h和12 h的高尿液Sema 3A水平与SCr升高及住院时间、AKI持续时间延长明显相关（P＜0.01）。而尿液Sema 3A水平与手术后48 h年龄、术后SCr变化、住院时间、AKI持续时间无相关性。见表7。

表7 尿液Sema 3A与临床指标的相关性分析

2.4 尿液Sema 3A与各项指标诊断CIAKI的性能评价

ROC曲线分析显示，SCr、β2-MG、Cys C术后48 h诊断CIAKI的AUC[95%可信区间（confidence interval，CI）]分别为0.821（0.542～0.963）、0.750（0.454～0.901）、0.839（0.593～0.965）。确定3种生物标志物的最佳诊断时间点为术后48 h，其中Cys C诊断性能最佳。

绘制尿液Sema 3A诊断CIAKI的ROC曲线并计算曲线下面积（area under curve，AUC）。6、12 h尿液Sema 3A的AUC分别为0.856（P＜0.000 1）和0.732（P=0.000 9），高于β2-MG、Cys C、SCr的AUC。尿液Sema 3A 24 h时的诊断性能稍低于血清Sema 3A。比较各时间点不同标志物的AUC和P值的预测模型，结果显示术后6 h的尿液Sema 3A的诊断性能最佳。

患者术后血清SCr、β2-MG、Cys C及血清、尿液Sema 3A的诊断性能见表8。术后尿液Sema 3A的ROC曲线分析见图2。

表8 Sema 3A、SCr、β2-MG、Cys C诊断CIAKI的性能比较

续表8

图2 术后6 h、12 h尿液Sema 3A诊断CIAKI的ROC曲线

进一步评价术后6 h尿液Sema 3A诊断CIAKI的最佳临界值，比较120、245、428 pg/μmol Cr 3个不同水平的诊断性能，结果显示当术后6 h尿液Sema 3A为245 pg/μmol Cr时诊断性能最优，此时敏感性为84%，特异性为92%，阳性预测值为91%，阴性预测值为87%。见表9。

表9 尿液Sema3A术后6 h诊断性能评价

3 讨论

CIAKI可导致急性肾衰竭，延长了患者的住院时间，增加了不良事件及终末期肾病的发生率。因此，实现对CIAKI的早期诊断，从而控制疾病的发生发展、改善患者预后已成为临床亟待解决的问题。CIAKI的发病机制十分复杂，还未被完全阐明。目前认为，对比剂引起的肾脏血流动力学变化[7-8]和对比剂的直接肾小管毒性[6]是CIAKI的主要发病机制。Sema 3A是抗血管生成因子，与细胞迁移相关。在生理条件下，通过Sema 3A的受体神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1，Nrp-1）、血管内皮生长因子受体2和整合素β3的相互作用来维持基底膜的完整性；当Sema 3A表达增加时，与Nrp-1结合增加，激活丛状蛋白-A1受体，从而影响毛细血管袢和肾小球基底膜的形成[4]。Sema 3A可在肾脏发育和成年人肾脏远曲小管上皮细胞中被检测到[7]，且在特定刺激下会分泌到尿液中，表明Sema 3A在肾脏损伤中发挥重要作用[9]。肾损伤时Sema 3A有可能参与了肾小管上皮细胞的增殖和迁移。有研究结果显示，Sema 3A在肾脏发育和损伤中具有重要作用，可通过调控足细胞分化来影响肾小球发育[10]。在药物刺激或缺氧条件下，Sema 3A自肾远曲小管上皮细胞分泌至尿液中[11]，引起短暂的大量蛋白尿，导致血管内皮细胞损伤。本研究结果显示，冠状动脉造影后数小时Sema 3A水平明显升高，很容易从尿液中检出。CIAKI患者血清、尿液Sema 3A水平在术后6 h达到最高，而血清β2-MG、Cys C、SCr则在术后48～72 h才升高，Sema 3A峰值的出现远早于其他AKI标志蛋白。由此可见，肾损伤时尿液Sema 3A可在短时间内升高，可作为早期诊断CIAKI的生物标志物。ROC曲线分析显示，术后6 h尿液Sema 3A诊断CIAKI的性能最佳，最佳临界值为245 pg/μmol Cr，敏感性为84%，特异性为92%，阳性预测值为91%，阴性预测值为87%。Logistic回归分析显示性别、术后6 h Sema 3A水平是独立预测CIAKI的指标。

综上所述，本研究结果证实Sema 3A可作为CIAKI的早期生物标志物，对CIAKI具有早期诊断价值，可以帮助临床尽早对CIAKI患者实施干预，对降低医疗费用和患者死亡率具有重要的价值。