上皮钠离子通道阻滞剂阿米洛利对雌性大鼠骨代谢的影响

张延娇 陈 博

(广东医科大学基础医学院生理科学实验室，广东 东莞 523808)

雌激素在维持雌性骨代谢平衡中起重要作用。研究证实雌激素的生物学功能主要由雌激素受体(ER)介导，而骨细胞上的ER数量很少，且雌激素与ER的结合率也很低〔1～3〕。雌激素在体内的代谢除雌激素经典途径，还存在替代通路〔4～6〕，目前雌激素影响骨代谢的机制尚未完全阐明。离子通道是细胞间相互通信和传送电信号的便利途径。上皮钠离子通道(ENaC)具有多方面的生理功能，包括酸感受、维持钠平衡和感应传导机械应力刺激。研究表明ENaC表达存在性别差异，雌激素能调节和影响肾脏、肺、子宫等器官钠通道蛋白或ENaC亚单位基因表达〔7～9〕，并影响ENaC生理作用(如子宫水钠潴留，血压等)。ENaC在成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞上都有分布。研究证实ENaC参与骨代谢，在成骨细胞中ENaC参与雌激素促进骨形成过程，雌激素的促成骨作用能被ENaC阻滞剂阿米洛利(Ami)抑制〔10〕。Ami处理破骨细胞后，细胞上ENaC表达减弱，同时抑制破骨细胞的形成，表明ENaC影响骨吸收〔11,12〕。本文探讨ENaC受体阻滞剂Ami对不同雌激素水平下骨代谢的影响。

1 材料和方法

1.1试验动物 3月龄雌性SD大鼠〔广东省南方医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(粤)2011-0015〕40只，SPF级，体重160～180 g。适应性喂养1 w后开始实验。

1.2试验药品与试剂 盐酸Ami(纯品)粉剂；碱性磷酸酶试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)；N端骨钙素(N-MID)(100T)检测试剂盒(德国罗氏，批号：17233501)；CalsetN-MID定标液(L&H，德国罗氏，批号：17225901)；雌二醇(E2)(100T)检测试剂盒(德国罗氏，批号：17207803)；CalsetE2定标液(德国罗氏，批号：17286601)。

1.3动物造模与分组 随机数表法将大鼠分成5组，每组8只，分别为基础对照组、假手术组、假手术组+Ami组、去卵巢组、去卵巢+Ami组。基础对照组适应性喂养后，于实验初始时处死取材。实验中以2‰羧甲基纤维素钠作为助悬剂。假手术+Ami组和去卵巢组+Ami组Ami给药剂量为10 mg·kg-1·d-1，假手术组和去卵巢组给等体积2‰羧甲基纤维素钠溶液，灌胃给药8 w。

1.4实验方法 各组每7 d称重1次，以测定时间为横坐标，体重为纵坐标，绘制生长曲线。应用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测ALP，N-MID、E2采用电化学发光法测定，具体步骤按说明书操作。处理好的股骨标本沿长轴垂直固定于样品固定器内。vivaCT 40选择扫描参数：图像矩阵为1 024×1 024，能量/强度为70 kVp、114 μA、8 W。选取距生长板远端1.0 mm、层厚3.0 mm的骨组织为感兴趣区域行三维重组，获得重组图像后使用micro-CT自带软件定量分析。

1.5统计方法 采用SPSS13.0软件进行正态分布检验、非参数检验、方差分析。

2 结 果

2.1ENaC阻滞剂Ami对雌性大鼠体重的影响 与假手术组比较，大鼠去卵巢2 w后体重呈显著性增加(P<0.05，P<0.01)。而假手术组和假手术+Ami组体重仅表现出正常增长。Ami对体重无影响。见表1。

表1 各组体重比较

与假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;3)因操作失误1只大鼠死亡

2.2盐酸Ami对骨量的影响 与基础对照组比较：假手术组骨体积(BV)、骨总量(TV)显著增加(P<0.01)，骨小梁分离度(Tb.Sp)显著性降低(P<0.05)，表明随着实验进程股骨在生长。与假手术组比较：去卵巢组BV、BV/TV、骨小梁数量(Tb.N)明显降低，Tb.Sp明显增高(P<0.01)，提示生长期大鼠去卵巢2个月能够成功建立骨质疏松模型；假手术+Ami组BV明显增加(P<0.01)，BV/TV、Tb.N、Tb.Th均增高，而Tb.Sp降低，且差异均无统计学意义(P>0.05)，提示Ami对正常大鼠骨量无影响。与去卵巢组比较，去卵巢+Ami组BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均显著降低(P<0.01)，而TV、Tb.Sp显著增高(P<0.05，P<0.01)，提示Ami加剧去卵巢大鼠的骨丢失。见表2、图1、2。

表2 各组骨量比较

与假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与去卵巢组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；5)因操作失误1只大鼠死亡；下表同

图1 各组microCT股骨下段的三维重建

图2 各组microCT股骨下段纵切面

2.3盐酸Ami对血清激素的影响 与假手术组比较：基础对照组血清E2、ALP、N-MID水平显著升高(P<0.05，P<0.01)，去卵巢组和去卵巢+Ami组血清E2水平显著性下降(P<0.05，P<0.01)，N-MID显著增高(P<0.05)。表现出高骨转换过程中骨形成活跃。见表3。

表3 各组血清激素水平比较

3 讨 论

绝经后骨质疏松主要是雌激素水平下降导致骨吸收和骨形成失去动态平衡而出现的代谢性骨病，属于老年病范畴。ENaC是许多药物作用的靶点，受多种激素和药物调节〔10〕。体外实验证实，雌激素促进成骨细胞增殖和成骨相关基因表达，同时上调ENaC mRNA表达,应用LNaC阻滞剂能阻断雌激素的促成骨作用，提示ENaC参与雌激素调节下成骨作用〔9〕。ENaC也参与调控破骨细胞分化和骨吸收过程〔12〕，在关节炎和骨质疏松的发病过程中起作用，可能是防治骨质疏松的新靶点。

Ami是临床应用的一种保钾利尿剂，可以抑制钠离子通道、质子通道、一些钠离子相关转运体(Na+-H+反向转运体、Na+-Ca2+交换体)等多个离子通道。Ami常常作为非特异性钠离子通道阻滞剂，在基础研究中,也常作为一种药理学工具被广泛应用。体外对破骨细胞实验证实，Ami能够抑制破骨细胞内ENaC表达，抑制破骨细胞的分化和骨吸收；同时也有实验表明Ami能抑制雌激素的促成骨作用〔10,12〕。骨代谢是骨形成和吸收相互耦联的动态过程，本实验结果表明Ami能加剧去卵巢所致高骨转换状态下的骨丢失，而对假手术组骨量无明显影响，但实验中无论假手术大鼠还是去卵巢大鼠，Ami均未表现出对骨形成的影响，推测可能是直接或间接影响骨吸收过程影响骨代谢，尚需进一步实验证实。