hENT1单核苷酸多态性与接受含吉西他滨方案非小细胞肺癌患者疗效的关系

吴风雷 宋子琰 刘 毅 郑义同 卞保祥

(徐州医科大学附属连云港医院，江苏 连云港 221002)

最新的数据统计表明，肺癌在所有的恶性肿瘤中发病率最高〔1〕，其中大部分(约80%)病理类型为非小细胞肺癌；而且绝大部分患者一经诊断就是晚期，失去手术机会。化疗是晚期非小细胞肺癌治疗的基本手段，但5年生存率也只有15%左右〔2〕，临床上经常会遇到不同非小细胞肺癌患者接受同一种方案化疗，但疗效却相差甚远。单核苷酸多态性(SNP)指DNA序列上发生的单个核苷酸碱基之间的变异。这种遗传多态性可导致基因组编码的相应蛋白结构和功能发生改变，从而导致不同个体对疾病的易感性及药物的疗效差异〔3〕。SNP的这种特点决定了它能够应用于肿瘤的治疗和预后等有关研究。因此，检测某些特定基因特定位点的SNP，观察其在不同个体或人群中基因序列上的差异，可用来提前预测恶性肿瘤患者对不同化疗药物的疗效，使精准个体化化疗成为可能。

吉西他滨属核苷类药物，是第三代抗肿瘤化疗药物，对肿瘤细胞的DNA合成期(S期)产生作用，也可阻滞肿瘤细胞从合成前期(G1期)向合成期甚至合成后期(G2期)发展。该药物需通过细胞膜上的载体将其转运至胞内，其中最重要的载体是人类平衡型核苷转运蛋白(hENT)1。已有研究表明在实体肿瘤患者中，hENT1(-706)GC基因型与GG基因型相比，前者能降低10%的吉西他滨体内清除率〔4〕。本研究探讨 hENT1(-706)SNP与含吉西他滨为主的化疗方案对非小细胞肺癌患者疗效间的关系，为指导临床个体化精准治疗提供一定的生物预测标志。

1 资料与方法

1.1一般资料 2009年1月至2012年12月共纳入连云港第一医院肿瘤科和淮安市第一人民医院的225例非小细胞肺癌患者，其中男性146例，女性79例，年龄33～79岁，平均55岁；鳞癌120例，腺癌105例；高分化61例，中分化82例，低分化82例。ⅢA期126例，ⅢB期87例，Ⅳ期12例，其中hENT1(-706)位点GG基因型124，GC基因型90例，CC基因型11例。患者均配合良好，取得准确数据。

1.2化疗方案及评价标准 所有患者接受以下的化疗方案：吉西他滨剂量及用法：1 000 mg/m2，用药时间为化疗开始的第1和第8天。顺铂剂量及用法：一次40 mg/m2，连用3 d，第2～4天给药。卡铂：曲线下面积(AUC=4～5 mg·ml-1·min-1)，第1天，21 d为1个周期。以实体瘤疗效评价标准评价疗效：完全缓解(CR)：病灶完全消失4 w以上；部分缓解(PR)：单个病灶或多个病灶的长径总和缩小超过50%超过4 w以上；进展(PD)；出现新病灶，单个病灶或多个病灶的长径总和增大超过20%；稳定(SD)：单个病灶或多个病灶的长径总和缩小介于PR和PD之间，通过客观缓解率(ORR)CR+PR的总例数和总生存期(OS)即从患者开始接受化疗的日期至患者最终死亡的日期作为观察指标评价化疗疗效。

1.3基因组DNA提取 所有患者化疗前抽取静脉外周血2 ml。采用Dneasy®blood&tissue 试剂盒(Qiagen，Hiden，Germany)提取外周血基因组DNA，-20℃冷藏备用。

1.4PCR扩增目的基因并对目的位点进行测序 hENT1 G-706C的引物为：正义5′-GGGAGCAGGAGAGGGACGCT-3′，反义3′-AGGCAGGCAAGAGGACGAGAGG-5′，反应体系总体积为30 μl，包括模板1 μl，10×缓冲液3 μl，10 mmol/L dNTP0.5 μl，rTAq酶0.5 μl，正向引物0.5 μl，反向引物0.5 μl。扩增条件为：变性：95℃30 s，退火：56℃30 s，延伸：72℃30 s，总共35个循环，PCR扩增产物送上海欧易科技有限公司在Biosystems DNA测序仪进行单向测序。

1.5统计学应用 采用SPSS18.0软件进行χ2检验、非条件Logistic回归分析、Kaplan-Meier分析、Log-rank检验、Cox比例风险回归模型。

2 结 果

2.1hENT1(-706)基因多态性和化疗疗效之间的关系 肺癌患者ORR与其hENT1(-706)位点SNP相关(P<0.05)，hENT1(-706)GG 基因型的患者ORR明显高于GC或CC基因型(图1，表1)。

图1 hENT1G-706C位点基因测序

表1 化疗敏感性和hENT1G-706C 位点基因多态性之间的关系

1)非条件Logistic回归校正了年龄、性别、美国东部肿瘤协作组评分、分期、分级

2.2hENT1(-706)基因多态性和OS之间的关系 携带hENT1(-706)OS：GG 为19.0个月，GC为 15.7个月，CC为14.5个月，GG与GC，CC比较差异具有统计学意义(P<0.001)，GC，CC比较差异无统计学意义(图2)。将hENT1(-706)GC和CC基因型合并，与GG型比较，生存时间显著减少(P<0.001)(表2，图3)。将临床病理等相关的因素与基因型之间的联系通过Cox 回归模型(单因素及多因素)分析显示，基因分型、临床分期及分化程度与OS相关。携带hENT1(-706)GC或CC基因型的患者死亡风险明显高于GG

基因型的患者(P<0.05)(表3)。

表2 hENT1(-706)基因多态性和OS之间的关系

图2 hENT1(-706)GG，GC，CC基因型NSCLC患者的总生存曲线

表3 晚期NSCLC预后影响因素的Cox多因素回归分析结果

HR风险比，HR>1 表明OS时间短;1)OR通过单变量非条件COX回归分析;2)OR通过多变量非条件COX回归分析

图3 hENT1(-706)GG，GC+CC基因型NSCLC患者的总生存曲线

3 讨 论

化疗是目前NSCLC患者综合治疗的重要手段之一。但是，不同患者即使接受了相同的化疗方案，疗效或不良反应可能会存在很大的差异。近年来，越来越多的研究表明药物相关酶基因SNP和化疗药物敏感性密切相关。

吉西他滨是亲水性化疗药物，需要通过相应的核苷载体才能进入肿瘤细胞发挥药效。目前已经被确认总共有5种核苷转运载体和吉西他滨转运有关：人富集型核苷转运蛋白(hCNT)1-3和hENT1-2。其中hENT1的转运作用最重要〔5〕。hENT1缺乏的肿瘤细胞对核苷类药物耐药〔4〕。Wei等〔6〕通过纳入10项研究对399例接受吉西他滨治疗的胰腺癌患者进行Meta分析发现：hENT1预测是吉西他滨疗效的生物靶标。Deng等〔7〕发现hENT1高表达的晚期胆道癌患者接受含有吉西他滨方案的化疗效果要优于低表达的患者。Elebro等〔8〕建立肺癌组织块活体移植动物模型发现，吉西他滨对hENT1阳性表达的负瘤裸鼠总生存时间明显长于对照组。已有研究表明携带hENT1 mRNA高表达患者中大部分单倍体型为CGG，CGC〔9〕。因此，hENT1 SNP与吉西他滨药物敏感性相关很有可能是改变了hENT1表达水平所致，接下来的研究将检测患者hENT1基因及蛋白表达，对其可能的机制进一步阐明。Myers等〔9〕发现hENT1-1345C>G、-1050G>A和-706G>C 3位点的基因多态性影响hENT1蛋白表达，而hENT1CGG/CGG野生型单倍体型和CGG/CGC突变型单倍体型主要的变异位点是-706G>C。推测hENT1-706G>C位点基因多态性在影响hENT1表达中起重要作用。Gusella等〔4〕发现hENT1GC基因型患者对吉西他滨血清清除率明显低于GG基因型患者。本实验结果提示GG基因型患者对GP方案化疗更敏感。其机制可能是hENT1(-706)GG基因型改变了hENT1基因启动子的转录活性，降低了hENT1的表达，从而影响了吉西他滨进入肿瘤细胞内的浓度。推测：hENT1(-706)位点SNP是一个潜在的独立的化疗疗效预测因子。本研究表明，hENT1(-706)位点SNP可能与接受GP方案化疗晚期NSCLC患者的敏感性相关，携带GC或CC基因型患者可能提示预后不良。该结果与Myers等〔9〕的研究中提及野生型和变异性单倍体型中hENT1(-706)是影响hENT1表达中最关键的SNP位点相一致。同时，需要指出的是：本实验结果和Gusella等〔5〕研究相反，Gusella等〔5〕发现hENT1(-706)GG型患者的吉西他滨血浆清除率明显高于hENT1(-706)GC型患者。这可能是因为不同种族人群对同一种化疗药物的特异性不同。本实验存在一定不足之处：hENT1(-706)位点SNP是否会影响hENT1表达仅在理论上及以前相关研究结果进行推测，因此，在后续研究中应该进一步进行基因及蛋白表达水平的测定，并对结果进行关联性分析，进一步明确相关耐药机制。