肝激酶B1基因表达与非小细胞肺癌预后的相关性

金艺凤 田 静 王 莹 焦南林 汪向海 邢 敏

(皖南医学院附属弋矶山医院呼吸与危重症科，安徽 芜湖 241001)

肝激酶(LK)B1作为抑癌基因，也被称为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11，定位于19p13.3。LKB1缺失可破坏上皮细胞极性，促进肿瘤进展、侵袭和转移。研究显示乳腺癌患者低LKB1蛋白表达水平与较差的总生存期(OS)相关〔1〕；人类表皮生长因子受体(HER)2阳性乳腺癌患者低LKB1蛋白表达水平是OS的潜在预测因子〔2〕。研究表明非小细胞肺癌(NSCLC)患者LKB1蛋白表达缺失的患者预后较差，且LKB1低表达水平与临床病理特征相关〔3〕。本研究探讨LKB1在NSCLC患者中的表达情况及与临床病理特征、预后的相关性。

1 材料与方法

1.1材料 总RNA抽提试剂Trizol购自Invitrogen公司，逆转录聚合酶链反应试剂盒、SYBR Green染料均购自Takara 公司。LKB1抗体为兔抗人的多克隆抗体购自Proteintech公司,内参GAPDH抗体购自Biosharp公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G购自Jackson Immuno公司。石蜡包埋组织提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。

1.2病理标本 选择2014年2月至2016年8月在皖南医学院弋矶山医院胸外科行肺癌切除术的患者23例，经病理确诊为NSCLC(鳞癌10例、腺癌13例)，同时选择距癌肿边缘5 cm以上的正常肺组织，经病理证实无转移。23例NSCLC患者进行术后无进展生存期(PFS)随访，随访截止至2016年12月28日。至截止日共18例肺癌组织标本资料完整、有随访结果。NSCLC患者根据第8版国际肺癌TNM分期标准修订稿〔4〕进行分期，术前均未接受过放化疗及免疫治疗。根据23例NSCLC患者LKB1基因蛋白、mRNA表达的中位水平(0.534、0.227 3)分成两组；蛋白低表达组12例，高表达组11例；mRNA低表达组13例，高表达组10例。

1.3实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR) 细胞总RNA按Trizol试剂盒说明书提取并定量。取1 μg RNA逆转录合成cDNA。在RT-PCR仪器上进行扩增，以β-actin为内参。LKB1反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共40个循环，LKB1基因上游引物为5′-CATGACTGTGGTGCCGTACT-3′，下游引物为5′-GTGACTGGCCTCCTCTTCTG-3′；β-actin的上游引物为5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3′，下游引物为5′-TCATGAGGTAGTCAGTCAGG-3′，基因的表达量用2-ΔΔCt表示。

1.4Western印迹实验 提取石蜡包埋组织中的蛋白质，把含30 μg蛋白质样品液与5×十二烷基硫酸钠(SDS)电泳样品缓冲液混合后，在沸水中煮沸5 min变性后，经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。转好的PVDF 膜置于5%脱脂奶粉中4℃孵育过夜，加入封闭液稀释的LKB1一抗(1∶1 000)，以GAPDH(1∶1 000)为内参，室温孵育2 h，三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBST)洗膜3次，每次10 min；再加入封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)，室温孵育2 h，TBST 洗膜3次，每次10 min，增强型化学发生显影。Tanon GIS 1D4.2图像分析软件分析。用软件ImageJ 1.37v对目标条带的光密度值进行分析处理并记录。实验重复3次。

1.5统计学方法 采用SPSS16.0软件行单因素方差

分析、LSD-t检验、Kaplan-Meier法分析。

2 结 果

2.1LKB1基因蛋白及mRNA表达水平 肺癌组织LKB1基因蛋白表达(0.600±0.182)和mRNA表达(0.322±0.215)显著低于癌旁正常组织LKB1基因蛋白表达(1.114±0.951)和mRNA表达(1.086±0.446)(P<0.05)。见图1。

1～6为6例NSCLC患者图1 各组LKB1基因蛋白表达

2.2LKB1基因蛋白、mRNA表达水平与临床病理关系 LKB1蛋白、mRNA表达年龄、临床分期、肿瘤大小患者中差异无统计学意义(P>0.05)；在不同分化程度患者中存在统计学差异(P<0.05)。见表1。

2.3LKB1基因蛋白、mRNA表达水平与NSCLC患者PFS的关系 LKB1基因蛋白低表达组中位PFS〔9.07(95%CI:5.80～12.34)个月〕明显短于高表达组〔15.36(95%CI:12.52～18.20)个月〕(P=0.006)。LKB1基因mRNA低表达组根据LKB1基因mRNA表达的中位水平(0.2273)分组中位PFS〔8.20(95%CI:6.29～10.11)个月〕明显短于高表达组〔16.57(95%CI:11.20～21.94)个月〕(P=0.000)，见图2、3。

表1 LKB1基因蛋白、mRNA表达与临床病理关系

图2 LKB1基因蛋白表达水平与PFS的关系

图3 LKB1基因mRNA表达水平与PFS的关系

3 讨 论

LKB1几乎在所有组织中都有表达，参与多种细胞过程，包括细胞结构控制、细胞周期调节、细胞凋亡和细胞代谢〔5〕。作为多功能蛋白，LKB1基因是腺苷磷酸激活蛋白激酶(AMPK)通路的主要上游激酶，也是细胞代谢中维持能量平衡的必需元素。LKB1通过激活一组与AMPK相关的激酶来发挥生长抑制作用，通过LKB1激活AMPK相关的激酶在维持细胞极性、抑制癌细胞的异常生长起着至关重要的作用〔6〕。研究表明LKB1作为抑癌基因，通过激活AMPK通路或AMPK相关的激酶，调节细胞周期、细胞凋亡、细胞极性和新陈代谢〔7〕。

LKB1基因在NSCLC常表现为表达缺失或失活突变，且LKB1表达缺失与肺癌发展、肿瘤分化、侵袭与转移相关〔8〕。李作生等〔9〕研究显示LKB1基因蛋白的阳性表达率在高分化组、无淋巴结转移组明显高于中-低分化组、有淋巴结转移组，认为LKB1低表达可能影响肺癌的预后。李洋等〔10〕检测了74例肺癌组织的LKB1、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)表达水平，发现LKB1表达缺失与肺癌侵袭、临床分期相关，而与性别、年龄、病理类型无关，认为检测其蛋白表达可作为NSCLC预后的判断依据。Xiao等〔11〕对14篇文献共1 915例实体瘤患者进行Meta分析，结果显示实体瘤患者低LKB1表达水平与预后较差相关，可作为临床病理预后的潜在预测因子。但也有研究〔12〕显示LKB1在细胞内位置不同临床意义也不同，乳腺癌患者细胞质LKB1高表达水平与OS和DFS显著下降相关，是预后较差的独立预后因子；而细胞核LKB1高表达水平与OS和DFS显著增加相关。

本研究说明LKB1基因的表达异常在肺腺癌和鳞癌中均存在。LKB1基因的表达降低可能导致对肿瘤的抑制作用减弱，进而使肿瘤的恶性程度增加。但本研究中LKB1基因的表达高低与年龄、病理类型、临床分期、肿瘤大小无关，可能与样本数较少有关，在今后研究中将加大样本量进一步研究。但由于随访时间较短，对OS无法作出评估，还有待进一步研究。

综上，LKB1基因表达水平与NSCLC的组织分化程度相关，且LKB1低表达可能提示预后不良。