药用植物多态性研究进展

沈徐婷，丁志山

(浙江中医药大学 医学技术学院，浙江 杭州 310053)

1 引言

药用植物是体内含有某些有效成分的一类植物，可用于预防和治疗疾病，是中药材的主要来源。几千年来，药用植物在自然条件或人为因素下经历了产地迁徙和杂交变种，使其种类和价值更加多样，丰富了药用植物多态性。然而，由于药用植物被破坏性采集，野生资源急剧减少，急需对其多态性现状进行研究，为保护药用植物野生资源提供理论依据，挽救其资源日渐枯竭的现状。

药用植物多态性，包括物种多样性、生态环境多样性和遗传多样性。遗传多样性是药用植物多态性的基础和核心，具体表现在形态学、细胞学、生物化学和DNA分子生物学层面。本研究基于已有文献资料，对药用植物多态性研究技术与应用进行综述与展望。

2 药用植物多态性研究技术

2.1 同工酶分析技术

目前，已有100多种同工酶被研究，其中药用植物方面研究中最为常见的有过氧化物酶、超氧化物歧化酶、酯酶和过氧化氢酶等。同工酶标记法凭借其酶活性不易丢失，技术简单，材料丰富和成本较低等优点已经成为检测药用植物遗传多态性的主流方法之一。同工酶分析技术使用电泳和组织化学方法特异性地染色和分离酶蛋白分子，并直接标记染色区带中的相应位置和活性。它包括了同工酶的分离、染色、酶谱分析与聚类分析四个步骤，其中聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(PAGE)凭借其操作简单、分辨率高、同工酶活性不易丢失等优点，成为同工酶分离的主流技术。

刘贺贺等[1]利用PAGE分析了75份蕨麻种质资源，建立POD同工酶酶谱进行差异性研究，并与形态学、分子学、细胞学结果比较，证实了蕨麻为适应复杂的地理环境发生了进化，形成了复杂的遗传变异和遗传资源多样性。

2.2 DNA甲基化分析技术

DNA甲基化分析技术包括检测特异性位点甲基化与全基因组甲基化两类,特异性位点甲基化中，最为常用的是亚硫酸盐测序法。全基因组甲基化检测方法主要包括甲基化敏感的扩增片段长度多态性法(MSAP)、甲基化敏感的限制性内切酶结合Southern印迹分析和甲基化特异性单核苷引物延伸(Ms-SNu PE)等。目前以MSAP技术在药用植物甲基化研究中使用更为广泛。

MSAP是一类用于研究生物体DNA甲基化状态的技术，是DNA甲基化定位和差异甲基化基因定位克隆的有效方法。使用限制酶MspⅠ和HpaⅡ消化和识别甲基化胞嘧啶能力的差异，将相同的DNA序列扩增出不同谱带，以此推断DNA的5'-CCGG位点的胞嘧啶甲基化状态和程度[2]。

Bednarek, P. T.等[3]提出了一种新的甲基化敏感扩增多态性(MSAP)方法，用于评估CCGG序列甲基化状态的相对定量特征，该方法还可用于分析影响CG和CHG情况的甲基化事件，植物在Al胁迫下差异甲基化。这种方法为研究植物非生物胁迫提供了有价值的工具。

Chwialkowska, K. 等[4]通过使用新一代测序(NGS)和自动化数据分析，使用高通量测序取代传统的聚丙烯酰胺凝胶上扩增子的分离，改进了基于MSAP的方法，称为甲基化敏感扩增多态性测序(MSAP-Seq)。MSAP-Seq允许基于全局序列的DNA甲基化变化鉴定。通过将高通量测序结合到MSAP-Seq中，可以在整个基因组中的数十万个位点进行DNA甲基化的平行和直接分析，可直接提供基因组定位的变化，并实现了定量评估。

2.3 指纹图谱分析技术

指纹图谱是指通过一些技术手段分析加工的复合物质，以及获得的能够代表其分子生物学或化学特征的光谱或色谱图。指纹图谱技术可广泛应用于某种生物体的DNA或蛋白质等，其中中药指纹图谱被广泛应用于中药鉴定、区分类别和分析有效成分等方面。该领域的分析技术包括高效液相色谱、核磁共振波谱、电化学方法、薄层色谱、气相色谱、紫外光谱和红外光谱等，常用的分析技术是高效液相色谱、薄层色谱和DNA指纹图谱。

2.3.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法(HPLC)作为一种高效的定性和定量检测方法，其原理是根据待测混合物中的各个组分在固定相和流动相之间分配比例的不同，从而达到成分分离的目的。它广泛应用于中药化学成分的检测，具有自动化程度高、分离效果好、灵敏度高、结果准确等优点。Doshi, G. M.[5]用高效液相色谱法(HPLC)确定了槲皮素和芦丁在冬瓜种子和假虎刺根中的具体含量。该技术还可独立应用于各成分的分离分析，在与质谱等技术联合使用时分析效果更为显著[6]。

2.3.2 薄层色谱法

薄层色谱法(TLC)是一种吸附薄层色谱色谱法，它利用相同吸附剂对每种组分的吸附容量的差异，在移动相(溶剂)流过固定相(吸附剂)的过程中使各组分相互分离。TLC作为鉴别药用植物最常用的方法，具有设备简单、操作方便、灵敏度好、显色容易等优点。依靠薄层板上是否存在斑点可以确定药材的真实性[7]，斑点颜色的深度及大小也可以在一定程度上反映出药材的质量。2015年版中国药典一部附录中的部分中药仍在使用TLC进行药材的鉴别分类。

2.3.3 DNA指纹图谱

DNA指纹图谱揭示了DNA分子层面上的多态性。该法使用特异性基因探针与片段杂交以获得特征性带型，即DNA指纹图谱，并与另一个体的DNA指纹图谱比较以评价个体DNA相似度的技术。DNA指纹图谱依托DNA分子标记法得以构建，基于分子杂交、PCR、特异标记等不同原理，发展得到扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、简单重复序列(SSR)、ISSR、单核苷酸多态性(SNPs)等多种方法。

扩增片段长度多态性(AFLP)技术结合了RFLP的优势，将引物识别序列连接到限制性DNA上，进行限制性片段的选择性PCR扩增。RAPD是与PCR技术基本原理相同的一类随机扩增多态性DNA标记技术。简单重复序列(SSR)又名微卫星DNA，是一类由1-6个核苷酸串联组成的重复单元。ISSR标记在SSR基础上发展而来，是一种新型分子标记，具有无需知道DNA序列、显性标记、重复性好等特点。单核苷酸多态性(SNPs)是群体个体的基因组序列中的单核苷酸碱基变异，形成遗传标记。Bhattacharyya等[8]为解决金钗石斛资源稀缺的现状，通过ISSR和DAMD标记对兰科类群进行了指纹图谱分析，并对总酚类、黄酮类和生物碱类成分进行了估算，揭示了整个样本群体显著水平的变异性。

3 药用植物多态性研究现状

随着对药用植物多态性的逐渐重视,已经有越来越多的药用植物在各个层次有了初步的多态性研究,而且必将会继续探索新的植物。表1列出了常见药用植物多态性研究情况，主要有兰科、豆科、五加科、毛茛科和伞形科。

4 药用植物多态性的应用

4.1 鉴定药用植物品种

药用植物多态性的研究可为品种鉴定、近缘植物鉴别与种群内亲缘关系追溯提供科学可靠的依据。DNA指纹图谱可直接、明确地鉴定品种；HPLC指纹图谱可从化学成分的角度提供识别依据，广泛应用于中草药的质量控制；同工酶指纹图谱可揭示种群内亲缘关系。陈云[21]利用HPLC对10批葛根药材进行检测，结果显示，仅有3批药材达到质量标准，其余均未达标；温强等[22]采用ISSR分子标记技术对紫花含笑进行鉴别，只用一个标记就可将紫花含笑与其他4个近缘种植物区分开来，同时获得的特异位点可将3个紫花含笑新品种区分出来。

4.2 指导改善药用植物的经济性状

根据药用植物所呈现的性状差异，推测影响其呈现多态性的因素，或利用杂交技术赋予其杂种优势，以改善药用植物的性状，提高药效成分含量；药效成分与药效学、药代动力学等相关研究的结合，为推动药用植物的临床应用开辟新途径。目前已有大量研究显示，低温、肥力调控、增强光照和干旱胁迫等都能诱导提高药用植物黄酮类药效成分[23]。李晓琼等[24]通过桉树杂交分别培育出了感虫性增加和抗虫性的子代桉树。

4.3 指导保护药用植物的种质资源

通过研究各种药用植物的生长特点和地域分布，可以指导栽培技术，制定优先保护策略，从而更好地保护药用植物的种质资源。李林轩等[25]发现，利用发根农杆菌R1601感染山豆根无菌苗子叶，在固体培养基上培养可诱导产生毛状根，且诱导率最高，毛状根在1/2 MS+IAA0.5 mg/L+5%蔗糖的培养液中生长情况最佳；Pe as 等[26]在研究了伊比利亚半岛、摩洛哥、加那利群岛的黄芪后，认为在伊利比亚范围内，保护研究中编号为AE4和AE5群体样品可保证伊比利亚特有单倍型III和V的保存，保护加那利群岛的AE16将确保单倍型VII的保存，在摩洛哥境内可以优先保护AE10和AE11。

4.4 优化药用植物的地理分布

同一药用植物栽培在不同产地，会在不同环境条件中逐渐呈现多态性。某些药用植物在特定地域表现出优良的性状与品质，被称为道地药材，这为优化药用植物的地理分布提供了思路。徐菲等[27]通过HPLC技术对不同产地的石虎药效成分含量进行分析对比，构建石虎的适宜产区规划图，得出重庆、湖南、贵州的适宜种植区较大的结论。杨月等[28]为研究土壤中无机元素与三七药材品质的相关性，从云南省文山州、红河州、玉溪市和曲靖市4个产地的16个样品中采集种植三七的根和根际土壤,经过HPLC等技术分析了三七药效成分的差异，得出三七种植应选择Mg、K含量较高的土壤。

4.5 推测药用植物的历史发展过程

生物居群遗传变异的大小与其进化速度有着密不可分的关系，因而，对药用植物多态性的研究可推测其历史演变和进化过程，结合其生境还可以推测生境变化过程。例如，Zhao等[29]通过姜科距药姜属(Cautleya)和象牙参属(Roscoea)的演化历史分析,发现两个属大约起源于44 Ma(Ma即百万年)，在32 Ma发生分化，而随着喜马拉雅-青藏高原的第三次隆升(23 Ma)及其相伴的中南半岛快速侧向滑动，两个属的祖先分布区被“撕裂”成两个不连续的区域，此后异域分化为完全不同的类群。这两个属的演化历史正好映射了喜马拉雅-青藏高原早期不同隆升阶段的地质过程及其对植物多样性演化的影响。基于报春花属(Primula)的Armerina组和葱属(Allium)的Cyathophora亚属的研究表明，两个类群的分化大约发生在4-3Ma，推测是最后一次青藏高原隆升和横断山隆起形成的地理隔离障碍促进了属内物种分化[30]。

5 展望

随着疾病发生发展的多样化和复杂化，天然药用植物的临床需求逐年上升，其野生资源却日渐匮乏，寻找有效的保护措施迫在眉睫，其中，研究其多态性是保护药用植物资源的必要手段。通过分析药用植物多态性的现状及其变化趋势，并进一步探讨其理论基础，可为优化稀缺药用植物的栽培育种提供科学依据，为临床需求量大、价值高的药用植物的临床应用提供可靠保障。加之部分药用植物品系难以凭借经验区分，所以亟待通过研究药用植物多态性以建立科学的鉴别手段，明确其分类体系。综上所述，药用植物的多态性研究极具现实意义和应用前景，急需对更多的药用植物的多态性进行研究。