转GsERF71基因苜蓿的培育及耐碱性

王子君，陈冉冉，朱娉慧，于 洋，陈 超，孙晓丽，段香波，杜建英，任 皓，刘 琪，朱延明

(东北农业大学农业生物功能基因重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

紫花苜蓿(Medicagosativa)被称为“牧草之王”，是种植面积大、分布广泛的高蛋白豆科牧草，具有较高的经济价值[1-2]。苜蓿的根系发达、生长密集、茎叶繁多、覆盖度高，可对退化草地进行一定程度的植被恢复，从而遏制草地退化。因此，种植紫花苜蓿不仅促进畜牧业发展，还达到了防止水土流失和防风固沙的目的[3]。而传统育种存在时间长、见效慢、消耗人力等缺点[4]。采用基因工程技术手段培育耐盐碱转基因苜蓿新品种，对于盐碱地改良和发展畜牧业具有重大的战略意义，并能推动经济和生态的可持续发展[5]。

在耐盐碱转基因苜蓿方面，我国已取得了重大的研究进展。Tang等[6]将WRKY20基因转入紫花苜蓿中提高了苜蓿的耐旱和耐盐能力；李燕等[7]将MsZIP基因转入苜蓿中从而提高了苜蓿的耐盐性和耐旱性；王臻昱等[8]通过将GsGST19超量表达的方法，显著增强了转基因苜蓿的耐碱性。因此，耐盐碱转基因苜蓿对于促进奶业及草食畜牧业的健康发展和环境改善具有重要意义。

在植物中存在一类ERF基因，它属于AP2/ERF转录因子超家族[9]。根据结构域的个数将AP2/ERF转录因子分为3个家族：含有1个AP2/ERF结构域属于ERF家族；含有两个重复的AP2/ERF结构域属于AP2家族[10]；除了含有1个AP2/ERF结构域以外，还有另外的1个B3结构域则属于RAV家族。另外，根据AP2/ERF结构域中不同的保守氨基酸，又将ERF转录因子家族分为ERF亚家族和CBF/DREB亚家族。研究证明，DRE类转录因子可以结合DRE/CRT顺式作用元件来参与植物响应非生物胁迫[11]。而超量表达的ERF类转录因子可以显著提高植物对胁迫的耐性[12]；在拟南芥(Arabidopsis)中超量表达AtERF98可以显著提高植物的耐盐性[13]；超量表达CarERF116能够提高拟南芥对渗透胁迫和冷胁迫的耐性[14]；GsERF71的超量表达调节水稻(Oryzasativa)根部木质素的合成，最终提高水稻的耐旱能力[15]。由此可见，超量表达ERF类基因可以提高植物对相关胁迫的耐性。但目前研究多集中在对模式植物的功能分析上，对其他植物的研究报道较少。

因此，从野生大豆(Glycinesoja)转录组测序数据中得到的碱胁迫应答基因GsERF71，选用USER载体构建植物超量表达载体，采用EHA105农杆菌侵染苜蓿子叶节，将GsERF71基因导入紫花苜蓿中，获得抗性株系，并通过PCR、Southern blot、RT-PCR的技术获得转基因株系；分析在碱胁迫处理下的苜蓿生长状况及相应的生理指标，以期获得耐碱性转基因苜蓿，并确定转GsERF71基因能提高紫花苜蓿的耐碱性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

东北野生大豆，肇东紫花苜蓿(G07256)，大肠杆菌DH5α，根癌农杆菌EHA105菌株及植物表达载体pCAMBIA330035S均由东北农业大学农业生物功能基因重点实验室提供并保存；质粒提取试剂盒、植物总RNA、DNA提取试剂盒均购自全式金公司。引物合成及测序由英俊生物公司完成。

1.2 植物表达载体的构建

本研究基于东北农业大学农业生物功能基因重点实验室前期获得的碱胁迫应答基因Glyma02G016100，设计上下游引物(5′-GGCTTAAUATGTGTGGCGGTGCCATCAT-3′；5′-GGTTTAAUCTAATCGAAACTCCAGAGATCCCC-3′)。Pfu Turbo Cx Hotstart DNA Polymerase[16-17]进行PCR扩增并得到完整的CDS序列。回收目的条带后，将目的基因和被Sacl和Nt.Bbvcl双酶切后的pCAMBIA30035Su植物表达载体重新连接。得到CaMV35S强启动子调控，Bar基因作为筛选标记基因的植物表达载体pCAMBIA330035Su-GsERF71，通过冻融法将植物表达载体导入农杆菌EHA105中，用于下一步的试验。

1.3 转基因紫花苜蓿的培育

选取浅黄色、肾形饱满、形状完整的苜蓿种子进行灭菌，春化2 d后置于萌发培养基上培养8 d，在无菌苗的子叶节下方约1 mm处剪取子叶节并接种到预培养培养基上。2 d后用根癌农杆菌EHA105对苜蓿子叶节进行侵染，将子叶节接种于含有100 μmol·L-1乙酰丁香酮共培养的培养基中。于28 ℃暗培养3 d后对子叶进行除菌培养。使用100 mg·L-1的阿莫西林-克拉维酸钾的液体培养基冲洗子叶节，随后将外植体接种到含有0.5 mg·L-1的草甘膦的培养基上，进行继代培养。当子叶节分化出2～3 cm的不定芽时，剪取不定芽并浸泡在1 g·mL-1的IBA 1 min并转入生根培养基上诱导生根，约14 d左右长出不定根。当根系生长至2～3 cm长时，取出小苗，在水中进行驯化。待小苗适应环境后将抗性苗移栽到土中继续培养。最终获得抗性植株[18]。

1.4 再生植株的分子生物学检测

1.4.1PCR检测 利用Bar基因的特异性引物(5′-TGCACCATCGTCAACCACTACATCG-3′；5′-CCAGCTGCCAGAAACCCACGTCATG-3′)对抗性植株进行PCR鉴定。其中，含有GsERF71基因的重组质粒作为阳性对照，水和野生型株系的DNA为阴性对照，进行PCR检测。

1.4.2Southern Blot检测 为了鉴定GsERF71基因是否整合并遗传到苜蓿以及在苜蓿中的拷贝数，对PCR阳性植株进行Southern blot免疫印迹分析。CTAB法提取苜蓿DNA[19]，以GsERF71基因的特异性引物(5′-GGCTTAAUATGTGTGGCGGTGCCATCAT-3′；5′-GGTTTAAUCTAATCGAAACTCCAGAGATCCCC-3′)为探针。经过酶切、电泳、转膜、预杂交、杂交等步骤进行Southern blot检测。

1.4.3RT-PCR检测 以Southern blot检测得到的阳性植株叶片总RNA为模板制备cDNA，用于RT-PCR分析。GAPDH作为内参基因(5′-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3′；5′-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3′)，非转基因苜蓿作为阴性对照，用基因序列特异性引物(5′-AACTCCTTCGCCAAAGACGATGACT-3′；5′-ACCTTAGCCTTTTTGCCTCGGATTT-3′)对转GsERF71基因苜蓿进行RT-PCR检测。

1.5 转基因苜蓿的耐碱性生物学分析

1.5.1转基因植株的扦插扩繁 于2017年7-8月对苜蓿进行扦插扩繁。选取生长状况良好的、木质化程度均匀一致的枝条，每隔2～3个节点剪为一段，浸泡在1∶5 000的生根粉溶液中2 h后转移到含有蛭石∶珍珠岩∶草炭土比例为1∶1∶1的小钵中，模拟室外环境，16 h的光照8 h的黑暗的光照周期以及白天27 ℃夜晚20 ℃的昼夜温差，湿度70%的培养条件下培养28 d直至材料逐渐生根，地上部分长出新叶，将生根后的材料转移到蛭石∶珍珠=1∶1的小钵中继续培养，用稀释后的霍格兰溶液对植物进行浇灌，连续28 d[20]。得到900株转基因株系以及450株野生型株系。

1.5.2转基因植株的碱胁迫处理 选择生长状况一致的转基因和非转基因扦插苗，分别用含有0、100和150 mmol·L-1NaHCO3溶液的霍格兰营养液每两天浇灌一次扦插苗,连续两周后观察表型[21]。10株扦插苗为一组。3次重复下每个浓度共测量9组植株，统计株高。将植株从盆中取出，洗净根部，测量每个植株毛状根的长度。每个浓度下选取转基因株系60株，非转基因株系30株进行测量。

1.5.3转基因植株生理指标的测定 分别取不同碱胁迫处理条件下转基因植株和非转基因植株的叶片。测定每个生理指标需要转基因株系60株，非转基因株系30株。取同一株系不同枝条上的绿色嫩叶进行各项指标的测定。分别剪取叶片放入液氮中带回实验室，并储藏于-80 ℃冰箱中, 用于测定叶绿素和丙二醛的含量。测定相对质膜透性、过氧化物酶以及脯氨酸含量时则需要洗净叶片表面的残留物进行测定。称取0.05 g叶片放入离心管中，液氮冷冻后使用组织破碎仪震荡成粉末。采用丙酮法[22]检测叶绿素含量；选取叶龄相似的待测植物叶片，剪下后用沾湿的纱布包裹住留存待用。将剪下的叶片用清水冲洗几次直到洗去叶片表面的残留物。用蒸馏水洗2～3次后使用纱布擦干叶片表面，使用打孔器取直径1 cm的圆片，用电导法[23]测定相对质膜透性。取液氮冷冻后的0.05 g叶片，组织破碎仪震荡成粉末后用硫代巴比妥酸法(TBA)[24]来测定丙二醛含量。天平称取1 g植物材料，选用愈创木酚法[25]测定其活性。磺基水杨酸法[26]测定植物叶片中游离脯氨酸含量。以上形态指标及生理指标均设置3次生物学重复，为同一批培养同一浓度处理同时取样的不同植株。

1.6 数据分析

利用IBM SPSS Statistics 20.0进行数据统计和显著性分析，采用Excel 2007进行制图。

2 结果与分析

2.1 植物表达载体构建及农杆菌转化

根据野生大豆基因Glyma02G016100序列，设计特异性引物。PCR扩增得到GsERF71基因，将回收的基因片段与双酶切后的植物表达载体进行连接并转化到大肠杆菌，经过菌落PCR鉴定、测序得到正确的转化子。此重组载体上含有Bar基因和35S强启动子调控的GsERF71基因(图1)，使用冻融法将重组载体pCAMBIA330035Su-CsERF71转入农杆菌感受态细胞中，菌落PCR鉴定得到约900 bp左右的特异性扩增产物(图2)，表明重组质粒已成功导入根癌农杆菌中，可用于下一步侵染苜蓿子叶节的遗传转化。

图1 GsERF71植物超量表达载体的构建Fig. 1 Construction of GsERF71 plant overexpression vector

图2 植物表达载体pCAMBIAs330035Su-GsERF71导入农杆菌PCR鉴定结果Fig. 2 PCR identification results for the pCAMBIAs330035Su-GsERF71 plant expression vector were transformed into Agrobacterium

M,DL2000；+,阳性对照(pCAMBIAs330035Su-GsERF71质粒)；-,阴性对照(去离子水阴性对照)；1-4,阳性转化子。

M, DL2000 marker；+, positive control (pCAMBIAs330035Su-GsERF71plasmid); -, negative control(deionized water); 1-4, positive transformants.

2.2 GsERF71基因对紫花苜蓿的遗传转化

遗传转化具体流程如图3所示。经过无菌苗的培养、预培养、共培养、除菌筛选及不定芽分化伸长、生根培养等步骤，将含有pCAMBIAs330035Su-GsERF71植物表达载体的农杆菌侵染大约8 000个子叶节，最终获得了转GsERF71基因抗性植株69株。

2.3 转GsERF71基因苜蓿的分子生物学检测

2.3.1转GsERF71基因苜蓿的PCR检测 以抗性植株叶片总DNA为模板，含有目的基因的质粒作为阳性对照，非转基因植株基因组DNA为阴性对照，进行PCR检测。结果如图4所示。与对照组相比，阳性对照和抗性植株均扩增出了长度约450 bp左右的特异性片段。表明GsERF71基因可能已整合到苜蓿基因组中，一共得到阳性植株13株，阳性率为18.84%。

2.3.2转GsERF71基因苜蓿的Southern blot鉴定 为了鉴定GsERF71基因是否整合并遗传到苜蓿中并确定目的基因在苜蓿中的拷贝数，对PCR检测后得到的13株阳性植株进行Southern blot分析，Southern blot检测获得2株阳性植株，结果如图5所示。#15、#39两个株系均检测到杂交信号，表明GsERF71基因已成功整合到苜蓿基因组中，均为单拷贝，阳性率为15.38%。

图3 苜蓿遗传转化及植株再生Fig. 3 Genetic transformation and plant regeneration of alfalfa

A,种子萌发; B,8日龄无菌苗; C,预培养; D,共培养; E,不定芽诱导;F,不定芽伸长;G,抗性芽生根;H,抗性植株获得。

A, seed germination; B, 8-day-old seedling; C, preculture; D, Co-cultivation; E, adventitious bud induction; F, adventitious buds elongate and grow; G, resistant shoots rooting; H, resistant plants are obtained.

图4 转GsERF71基因抗性植株的PCR检测Fig. 4 PCR identification of resistant plants with GsERF71

M,DL2000 marker；+,阳性对照；-,水对照；CK,非转基因对照；1-9,转GsERF71基因抗性植株PCR扩增产物。下同。

M, DL2000 marker; +, positive control; -, water control; CK, control check; 1-9, amplification products of transgenic plants withGsERF71 gene. similarly for the following figures.

图5 转基因植株的Southern blot鉴定Fig. 5 Southern blot identification of transgenic alfalfa

2.3.3转GsERF71基因苜蓿的RT-PCR检测 以Southern blot检测得到的阳性植株叶片总RNA为模板制备cDNA，进行RT-PCR的检测分析，如图6所示。结果表明#15、#39株系中GsERF71已成功整合至苜蓿基因组并能在转录水平上有表达。阳性率为100%。

图6 转基因植株的RT-PCR鉴定Fig. 6 Semi-RT PCR of transgenic alfalfa resistant plants with GsERF71

CK为野生型，下图同。

CK, wild type; similarly for the following figures.

2.4 转基因苜蓿的耐碱性生物学分析

2.4.1碱胁迫下转基因苜蓿的表型分析 对转基因株系#15、#39和野生型株系的扦插植株统一进行碱胁迫处理，用NaHCO3模拟碱胁迫，选取生长状况一致的野生型和转基因株系，分别用含有0、100和150 mmol·L-1NaHCO3的霍格兰溶液连续处理14 d后，对野生型与转基因株系进行耐碱性分析。

对处理后的植株进行株高与根长的统计分析,发现碱胁迫下，转基因和非转基因苜蓿的株高和根长均受到抑制。随着碱胁迫浓度的增加，所有株系的形态指标均呈逐渐下降趋势。在NaHCO3未处理条件下转GsERF71基因与非转基因植株生长一致且无显著差异(P<0.05)；150 mmol·L-1NaHCO3的霍格兰溶液处理14 d后，转基因株系与对照株系的生长均受到抑制，所有植株的株高与根长均呈下降趋势，但非转基因株系减少的幅度更大，与转基因植株相比差异显著(P<0.05)，由此说明转基因株系表现出一定程度的碱胁迫抗性(图8)。

图7 #15和#39转基因株系的影响Fig. 7 Effect of alkali stress on strain #15 and #39

2.4.2碱胁迫下转基因苜蓿的生理指标检测 在不同梯度NaHCO3溶液胁迫下，转基因和非转基因植株的脯氨酸含量均呈现上升趋势(图9)。在相同浓度NaHCO3胁迫处理下转基因株系中的脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P<0.05)说明在碱胁迫下转基因苜蓿能够积累大量脯氨酸提高细胞渗透势来防止细胞失水，从而提高苜蓿的耐碱性。

图8 碱胁迫对转GsERF71基因苜蓿株高和根长的影响Fig. 8 Changes of plant height and root length of transgenic alfalfa with GsERF71 under alkaline stress

不同小写字母表示不同浓度不同材料间差异显著(P<0.05)，下同。

Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level; similarly for the Figure 9.

对转基因植株和非转基因植株的相对质膜透性分析，结果显示，未NaHCO3处理条件下转基因和非转基因苜蓿的相对质膜透性基本无差异。随着碱处理浓度的增高所有植株的相对质膜透性均呈现上升趋势，且非转基因植株相对质膜透性的上升幅度显著高于转基因植株(P<0.05)。由此表明，碱胁迫下非转基因植株细胞膜所受的损害较转基因植株更为严重，进一步说明转GsERF71基因的苜蓿细胞膜受到相对较轻的损害，因此能提高植株的耐碱能力(图9)。

丙二醛可以反映植物细胞内积累活性氧的程度。当植物受到碱胁迫时植物体内会产生大量的活性氧，因而测定丙二醛可以直接反映植物所受到的碱胁迫伤害。在100和150 mmol·L-1两种NaHCO3浓度的霍格兰溶液处理下，转基因植株叶片中的丙二醛含量显著低于非转基因植株(P<0.05) (图9)。说明与非转基因苜蓿相比，转GsERF71基因的苜蓿受到相对较轻的碱胁迫伤害。

在100和150 mmol·L-1NaHCO3溶液胁迫处理下，CK ，#15，#39植株的POD活性均有上升，且转基因株系的POD活性均显著高于对照株系(P<0.05)(图9)。说明转GsERF71基因苜蓿的株系能更好的还原过氧化氢，从而减少对植物细胞的伤害，达到延缓植株衰老的效果。

转GsERF71基因和非转基因的苜蓿叶绿素含量检测结果显示，碱胁迫会对植物体内光合作用相关元件造成伤害损伤，从而使植物失绿甚至死亡。在100和150 mmol·L-1NaHCO3浓度的碱胁迫下，#15和#39叶片中的叶绿素含量均高于非转基因株系(P<0.05)。说明转基因植株通过减少叶绿体的受损程度来提高其光合能力从而提高耐碱性。

图9 碱胁迫下转GsERF71基因苜蓿的生理指标检测Fig. 9 Physiological indices analysis of transgenic alfalfa with GsERF71 under alkaline stress

3 讨论

野生大豆具有耐盐碱、抗寒、抗病等优良性状，含有多种耐逆基因。作为豆科植物的野生大豆与紫花苜蓿具有高度同源性，野生大豆基因转入豆科作物中不存在异源表达的差异性，因而表达效率更高，被视为研究豆科作物耐碱转基因分子机理的理想材料[27]。根据前期构建的野生大豆碱胁迫转录组数据，从ERF类转录因子中筛选到响应碱胁迫相关基因GsERF71。已有研究证明，在拟南芥中，野生大豆碱胁迫相关转录因子GsERF71基因的超量表达可以提高植物的耐碱性[12]。GsERF71与其他物种的成员LeERF2和CaERFLP1也具有较高的同源性，向烟草中导入LeERF2基因明显增强了植物的耐盐性[28]；来自胡椒(LinderachieniiCheng)CaERFLP1基因可以提高烟草的耐盐性[29]。研究表明，这两个基因在不同物种中均能提高植物的耐盐性，而GsERF71基因已经被证实在拟南芥中可以提高植物的耐碱性[12]。因此推测GsERF71在同为豆科植物的苜蓿中也具有相似的功能。本研究主要从分子育种的角度来培育转基因植株并验证目的基因的耐碱性。结果显示，GsERF71基因在紫花苜蓿中的超量表达提高了其对碱胁迫的耐受力[30]，这一结果为豆科作物耐碱转基因分子育种提供了重要的基因资源[31]。

碱胁迫条件下，植物能够通过调节细胞质膜上H+-ATPase，维持细胞内环境的稳态和调控生长素的分布来响应碱胁迫[32-33]。GsERF71能够通过维持细胞内环境的稳定，调控H+-ATPase等胁迫相关基因来提高植物的耐碱能力[12]。GsERF71基因在野生大豆的根和下胚轴中表达量较高，而在其他组织中的表达量则相对较低，相差100～200倍；说明此基因在野生大豆组织中的分布都具有时空特异性。表达模式分析表明，GsERF71能够被碱胁迫快速诱导表达。碱胁迫下，GsERF71表达量在根中的变化更快更高，可能由于根部是最先接触到胁迫处理的部位。而且GsERF71在碱胁迫条件下的变化量要高于盐胁迫条件下，说明GsERF71对于碱胁迫的响应更显著，在植物响应碱胁迫过程中具有重要的作用。在拟南芥中超量表达GsERF71基因，通过对比野生型与超量表达植株对碱胁迫的耐性来确定GsERF71基因的功能。结果表明超量表达GsERF71能够显著提高植物各个生长时期对碱胁迫(NaHCO3)的耐性，说明GsERF71在植物响应碱胁迫过程中具有重要的功能。研究发现生长素合成相关基因ASA1和ASB1受碱胁迫诱导上调表达[34]，但是其表达量在GsERF71超量表达植株中要低于野生型植株，表明在碱胁迫条件下GsERF71可能间接或者直接负调生长素的累积。碱胁迫条件下生长素合成相关基因PAT1、PAI1和TRP倚赖的生长素合成基因TAR1、TAR2，NIT3还有IAA氨基酸合成酶基因GH3.2和GH3.3在GsERF71超量表达植株中的表达量均显著低于野生型植株。生长素结合基因ILL2和ILL3能够通过水解释放游离的生长素，其表达量在超表达植株中也显著低于野生型，表明在碱胁迫下GsERF71能够负调植物体内生长素的累积，从而减缓生长素过高对于根生长的抑制作用，表现出对碱胁迫耐性的增强。酵母单杂交试验发现，GsERF71在酵母细胞内能够与DRE和GCC元件结合，启动下游报告基因HIS的表达。DRE和GCC元件广泛存在于许多生物胁迫或非生物胁迫相关基因的启动子中，因此，GsERF71极有可能通过调控胁迫相关Marker基因的表达提高植物对碱胁迫的耐性。通过qRT-PCR方法检测了野生型拟南芥和超表达GsERF71拟南芥中胁迫相关基因RD29A、COR47和KIN1以及碱胁迫相关基因NADP-ME，V-H+-PPase和H+-ATPase[34-35]在碱胁迫条件下的表达模式。胁迫相关基因RD29A，COR47和KIN1的启动子中含有多个DRE和GCC元件，能够响应多种非生物胁迫和激素信号如盐、低温、干旱和ABA等[36]。这些胁迫相关基因在碱胁迫条件下均被上调表达，并且在超量表达植株中这些基因的表达量显著高于野生型植株。有研究报道H+-ATPase能够通过与14-3-3蛋白互作来提高植物对碱胁迫的耐性[35]，而该基因在GsERF71转基因植株中的表达量也显著高于野生型植株，GsERF71可能通过上调H+-ATPase及相关非生物胁迫应答基因的表达来提高植物的耐碱能力。因此，GsERF71通过正调控胁迫相关基因的表达来帮助植物提高耐碱能力的。

碱胁迫下，植物体内产生大量的活性氧，导致植物体内活性氧失衡，从而对核酸，蛋白质的大分子造成不利的影响。其中包括光合作用元件损伤影响光合作用，膜系统过氧化而改变质膜透性，产生丙二醛。而植物体内的活性氧机制可以一定程度上清除活性氧自由基，维持细胞活性氧代谢平衡。因此本研究测定的生理指标均可用来指示植物在碱胁迫下受到的损伤情况。苜蓿生理指标结果显示，在碱胁迫下GsERF71基因的超量表达可以调节相关酶活性，积累大量脯氨酸来提高细胞渗透势来防止细胞失水，清除植株在胁迫下产生的活性氧，防止脂膜被氧化而产生丙二醛，减少质膜损伤程度，维持细胞的稳定性，减少叶绿体的受损程度来提高植物的光合能力[37]。产生这一现象的原因可能是苜蓿中GsERF71基因通过上调H+-ATPase、NADP-ME、KIN1、RD29A等苜蓿碱胁迫相关基因的表达来提高植物的耐碱能力。

4 结论

综上所述，在苜蓿中超量表达GsERF71基因可以提高植物的耐碱能力。通过侵染苜蓿子叶节将GsERF71基因导入苜蓿中，对抗性苗进行分子生物学检测，得到转基因植株#15和#39，对植株进行模拟盐碱土地的碱胁迫处理，从形态指标株高和根长，生理指标脯氨酸、丙二醛、叶绿素、过氧化物酶活的含量以及相对质膜透性的表达量证实了GsERF71基因提高了苜蓿的耐碱性。