不同扁穗雀麦种质苗期抗旱性鉴定与评价

赵文达，杨晓鹏，孙铭，张成林，伍文丹，马 啸，张新全

(四川农业大学动物科技学院草业科学系，四川 成都 611130)

扁穗雀麦(Bromuscatharticus)为禾本科雀麦属一年生或越年生草本植物，又名野麦子[1]。最早于20世纪90年代末引入我国，在内蒙古、新疆、甘肃等地表现为一年生，在我国西南和华中地区表现为越年生[2]。扁穗雀麦再生性和分蘖能力较强，产草量略低于多花黑麦草(Loliummultiflorum)，且具有一定的抗旱性，幼嫩时茎叶有软毛，成熟时毛渐少，适口性仅次于黑麦草(Loliumperenne)和燕麦(Avenasativa)等。种子成熟后，茎叶仍为绿色，可保持较高的营养价值，其鲜草中家畜所需的必需氨基酸较丰富，赖氨酸含量较高，是解决我国冬春饲草缺乏的优良牧草[2]。

水分在植物的生命活动中起着重要的作用，许多植物在经受干旱逆境后各项生理指标均会受到一定的影响。植物苗期对水分的亏缺相当敏感，在干旱环境下，植物的幼苗易出现死亡情况，对植物生长和生物量的形成均有一定影响[3]。在牧草的生长发育过程中同样存在这种问题，所以水分也是制约牧草生物产量的重要因素[4]。扁穗雀麦起源于南美洲潘帕斯草原，喜温暖湿润气候，具有一定的抗旱性，草产量较高，常做短期牧草种植，但在其在我国的适种地区如西南、华中地区为亚热带季风气候，冬春季节较为干旱，可能会影响扁穗雀麦出苗和生长，并进一步影响到牧草总产量。

目前，国内外关于植物抗旱性特征的研究常通过测定干旱胁迫下植物的含水量、根冠比、干物质、株高等形态和生理指标，探究形态和生理指标的变化与其抗性之间的关系[5-7]。因此，本研究在前期筛选出20% PEG-6000的模拟干旱浓度下，对处于苗期生长的不同扁穗雀麦种质连续72 h干旱胁迫后，比较不同种质的叶片相对含水量(RWC)、相对电导率(REC)、丙二醛(MDA)含量、过氧化物酶活性(POD)、游离脯氨酸(Fpro)含量5项生理生化指标的变化，综合评价比较扁穗雀麦种质的苗期抗旱性，对抗旱种质的引种筛选和品种选育提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试21份扁穗雀麦种质资源，具体来源描述如表1所列。

1.2 试验设计

将培养皿放置于90 ℃下消毒5 h，扁穗雀麦种子用HgCl2消毒[8]。将消毒后的21份扁穗雀麦种质分别各取50粒种子进行培育，将培养皿放置于25℃的培养箱中，每天浇水一次。发芽出苗后待供试材料长至2～3片真叶时，将其移至锥形瓶。每个锥形瓶中放置5株材料，每份材料设置3个对照组，3个试验组，添加营养液进行12 h光照、12 h黑暗交替培养。待供试扁穗雀麦幼苗长至3～4片真叶时，取部分植株进行胁迫处理。胁迫处理采用PEG-6000溶于培养液，质量浓度为20%，对照组继续添加营养液，胁迫处理72 h后，抽取一部分植株进行生理生化指标测定[9]。每个指标设置对照和处理，进行3次重复试验。

1.3 测定项目与方法

在胁迫处理和对照处理上各取4片展开叶，用蒸馏水冲洗叶片表面污物，并用吸水纸吸干叶片表面水分，进行生理指标测试。其中，叶片相对含水量采用饱和称重法测定；相对电导率采用电导率法测定；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定；过氧化物酶活性采用愈创木酚法测定[10]；游离脯氨酸采用茚三酮法测定[11]。

1.4 数据分析与处理

各指标的抗旱系数[12]和隶属函数值[13]分别按照式(1)和式(2)进行计算：

指标性状的抗旱系数=干旱胁迫下性状指标值/空白对照性状指标值;

(1)

μ(x)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin) 。

(2)

式(2)中：μ(x)为种质材料性状抗旱系数的隶属函数值，若指标与抗旱性呈负相关关系，则用1-μ(x)表示；X表示某一指标的抗旱系数，Xmax和Xmin分别表示此种质某一指标抗旱系数的最大与最小值；且相对含水量、过氧化物酶活性和游离脯氨酸含量为正向指标，相对电导率和丙二醛含量为负向指标。

使用SPSS 20.0对抗旱系数等数据进行方差分析、多重比较、主成分分析、权重计算、抗旱性度量值计算和相关性分析。其中，方差分析和多重比较用来测试某一控制变量的不同水平是否给观察变量带来显著差异，即测定供试种质的各指标抗旱系数的差异显著性。主成分分析用来减少数据集的维数，同时保持数据集中的对方差贡献最大的特征。权重是指某指标在整体评价中的相对重要程度。权重越大则该指标的重要性越高，对整体的影响就越高。在试验过程中以主成分分析中第一主成分的指标特征值(取绝对值)为权重进行计算。抗旱性度量值是用各指标性状的隶属函数值与权重相乘后相加得到，能全面地比较供试材料的抗旱性。对两个或多个具备相关性的指标进行相关性分析，从而衡量两个指标间的相关密切程度。

2 结果与分析

2.1 各性状抗旱系数差异性分析

在干旱胁迫处理72 h后，测定供试材料的5个生理指标(表2)。供试材料基于同一指标的抗旱系数存在较明显的变异，其中相对电导率与游离脯氨酸含量的抗旱系数变幅较大，其变异系数分别达到48.96%和42.61%，表明相对电导率与游离脯氨酸含量对干旱胁迫的敏感性在不同种质间变异很高。同一材料不同指标的抗旱系数也呈现出较大的差异，如种质PI595114各指标抗旱系数变幅为0.940 9～25.285 1，种质PI217583各指标抗旱系数变幅为0.931 4～4.964 7，表明不同指标对干旱胁迫的敏感性差异较大。对比干旱胁迫前后的各生理指标变化发现，相对电导率、丙二醛含量、过氧化物酶活性和游离脯氨酸含量总体呈上升趋势，相对含水量总体呈下降趋势。

2.2 主成分分析

对多个指标性状进行主成分分析，结果如表3所列。前3个主成分的特征值累计贡献率达到了74.454%，可认为其具有较强的信息代表性，提取的3个主成分基本上代表了5个原始指标的绝大部分信息[14-15]。主成分1占据了原始数据信息的29.623%，且特征值较高，为1.481 1。主成分2与主成分3分别占原始数据信息量的24.389%和20.442%，特征值分别为1.219 4与1.022 0。在主成分1中起决定贡献率大小的因素主要是相对含水量、相对电导率，即相对含水量、相对电导率的抗旱系数越大，主成分1的的贡献率越高；主成分2中决定贡献率大小的为相对含水量、相对电导率、过氧化物酶活性、丙二醛含量的抗旱系数，主成分3中主要由丙二醛含量、相对含水量抗旱系数起决定作用。

2.3 各性状隶属函数值及抗旱性度量值

在计算抗旱性度量值之前，首先要计算各指标权重[16]。在主成分分析中，主成分1占据了原始数据信息的29.623%，因此，可以将主成分1中各性状的特征向量作为权重进行计算。利用公式(2)计算21份种质各性状抗旱系数的隶属函数(表4)，5种指标抗旱隶属函数值的变异系数都超过了10%，其中相对电导率、POD活性抗旱隶属函数值的变异系数超过了18%。将主成分1各抗旱系数的特征值占总特征值比例作为权重与对应的隶属函数值相乘，然后对不同种质分别进行乘积的求和，即可得到21份种质的抗旱性度量值(表4)。种质的抗旱性度量值越大，抗旱能力越强，反之则越弱。在21份种质中，抗旱性度量值的变异系数达到了83.53%，PI442076抗旱性度量值最高，因此抗旱能力最强；PI292258抗旱性度量值最弱。

表2 21份扁穗雀麦种质各生理指标的抗旱系数Table 2 Drought resistance coefficients of 5 physiological indices of the 21 Bromus catharticus germplasms

同列不同字母表示不同种质间差异显著(P<0.05)。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference between different germplasms at the 0.05 level.

表3 21份扁穗雀麦种质资源指标的抗旱系数主成分分析Table 3 Principal component analysis of drought tolerance coefficients of the 21 Bromus catharticus germplasms

*表示某指标在各主成分中的最大绝对值。

* means the highest absolute value of each index in all factors.

表4 21份扁穗雀麦种质的抗旱系数隶属函数值和抗旱性度量值Table 4 The subordinate function values and drought-resistance values of Bromus catharticus germplasms

21份扁穗雀麦种质不同指标抗旱系数和抗旱性度量值之间的相关性大小(表5)表现为，游离脯氨酸含量>相对电导率>过氧化物酶活性>相对含水量>丙二醛含量，其中相对电导率的抗旱系数与抗旱性度量值呈极显著负相关关系(r=-0.551，P<0.01)，游离脯氨酸含量的抗旱系数与抗旱性度量值呈极显著正相关关系(r=0.572,P<0.01)，而过氧化物酶活性、丙二醛含量、相对含水量的抗旱系数与抗旱性度量值之间无显著相关性。

2.4 聚类分析

为进一步分析不同扁穗雀麦种质的抗旱性优劣，对21份材料的抗旱性度量值进行聚类分析，将其分成不同耐旱型(图1)。在欧式距离阈值为0.045时，可将21份扁穗雀麦种质划分为4类抗旱能力不同的群组：Ⅰ类包括江夏及抗旱性度量值最高的PI442076等4份种质；Ⅱ类包括黔南等5份种质；Ⅲ类包括3份种质；Ⅳ类包括抗旱性度量值最小的PI292258等9份种质。由各种质的抗旱性度量值可以确定4类材料总体抗旱性强弱排序为Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ，Ⅰ类抗旱性最强，各测定指标表现优异，4份种质表现出优秀的抗旱能力；Ⅳ类抗旱性弱，各测定指标表现较差。

同时，对分成的4个抗旱型群组进行单因素方差分析(表6)，发现游离脯氨酸含量与相对电导率的隶属函数值显著差异(P<0.05)，相对含水量的隶属函数值表现出极显著差异(P<0.01)；丙二醛含量、过氧化物酶活性的隶属函数值差异不显著(P>0.05)；平均隶属函数值与抗旱性度量值均表现极显著差异(P<0.01)。

表5 抗旱系数和抗旱性度量值的相关性分析Table 5 Correlation analysis between drought tolerance coefficients of the 5 indices and drought-resistance values

*,P<0.05; **,P<0.01.

图1 扁穗雀麦抗旱性度量值聚类分析Fig. 1 Clustering dendrogram of the 21 Bromus catharticus germplasms based on drought-resistance value

3 讨论与结论

干旱胁迫对植物的影响表现在多个方面，对于胁迫造成的压力，生理代谢迅速做出调整以保证植物细胞能进行正常的生理活动[17]。在这个过程中渗透调节是植物抵抗干旱的主要方式，干旱环境下，植物体内的水分减少，糖、氨基酸和无机离子等溶质不断积累，植物渗透势降低，从而吸收水分，保持基本的生理活动。因此，测定在干旱胁迫下植物的相对含水量、相对电导率、丙二醛含量、过氧化物酶活性、游离脯氨酸含量等指标，可有效评价植物苗期的抗旱能力。

当在干旱胁迫下，牧草的生存和形成生物产量的能力下降，不同品种对干旱胁迫呈现出不同的抗性[18]。相对含水量降低的幅度愈小，牧草的抗旱能力就愈强，如多花黑麦草表现出抗旱性与相对含水量呈正相关关系[19]；而植物的相对电导率会随着质膜的选择透性被破坏呈上升趋势，与植物的抗旱能力呈负相关关系。此外，植物体内因干旱产生的丙二醛会导致植物细胞膜的损伤加剧，使细胞膜脂过氧化作用变强。因此，丙二醛含量增幅越高，植物的抗旱能力越弱[20]。过氧化物酶是一种保护性酶，对环境较为敏感，能够清除植物体内的活性氧，多数研究表明，在植物遭受逆境胁迫时，其体内的过氧化物酶活性会有所上涨[21]。游离脯氨酸除了作为植物细胞质内调节渗透外，还在稳定大分子结构、降低细胞酸性等方面其重要的作用，当植物受到干旱胁迫时，游离脯氨酸的含量会呈现增加趋势[22]。本研究通过对胁迫下和非胁迫下扁穗雀麦种质资源的相对含水量、相对电导率、丙二醛含量、过氧化物酶活性、游离脯氨酸含量的研究发现，胁迫处理后相对含水量呈现下降趋势，相对电导率、丙二醛含量、过氧化物酶活性、游离脯氨酸含量表现出上升趋势，与上述结论基本相符合。因此可以推断扁穗雀麦通过调节体内的一些生理活动如降低叶片含水量，增强酶活性来抵御水分胁迫对其带来的不良影响[23]。

表6 扁穗雀麦种质4个类组的各观测指标隶属函数值的方差分析Table 6 Multiple comparisons of the subordinate function values of 4 clusters of Bromus catharticus germplasms

不同小写字母和大写字母表示相同指标不同类组间差异显著和极显著(P<0.05和P<0.05);ns,表示差异不显著。

Different lowercase and capital letters indicate significant difference between different groups in the same parameter at 0.05 and 0.01 levels, respectively; **,P<0.01; *,P<0.05; ns, not significant.

植物抗旱性受多个基因的控制，是多个指标相互表达而呈现出的综合性状[24]。因此，单因素或单个性状分析并不能有效分析出21份扁穗雀麦种质的抗旱性强弱，需要综合多个性状，使单性状分析抗旱性的片面性得到有效的补充，尽可能准确的接近实际情况[25]。本研究通过测定多项生理指标并结合隶属函数分析及聚类分析，以抗旱性度量值来直观定量表示其抗旱性强弱，并划分了不同的抗旱型分组以对多个供试种质进行组群划分。

综上所述，供试21份扁穗雀麦种质资源经苗期模拟干旱胁迫，各项生理生化指标都存在明显差异。根据其抗旱性度量值，可将其分为4类不同的抗旱型，且抗旱性强弱顺序为Ⅰ类>Ⅱ类>Ⅲ类>Ⅳ类。材料PI442076的苗期抗旱性最强，材料PI292258的苗期抗旱性最弱，这为今后抗旱性品种选育及抗旱性分子机理研究提供了重要供试材料。