以多黏菌素为基础的七种联合方案对XDR-AB体外抗菌活性的比较

马淑珍,刘 原,和 平

(西安交通大学第二附属医院呼吸内科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:liuyuan@mail.xjtu.edu.cn)

鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii,AB)是一种非发酵、需氧革兰阴性杆菌,属不动杆菌群,无芽孢及鞭毛,是一种重要的机会性病原体,占所有革兰阴菌性所致医院感染的2%-10%,且亚洲的流行率高于欧洲和美国[1]。近年来,随着β-内酰胺类药物和免疫抑制剂的广泛应用,多重耐药、泛耐药鲍曼不动杆菌感染越来越严重,并迅速恶化[2]。泛耐药鲍曼不动杆菌(XDR-AB)定义为对除多黏菌素和替加环素以外所有抗菌药均耐药[3]。碳青霉烯类是治疗敏感AB感染的首选药物之一,也是进行经验性治疗的首选药物。然而,碳青霉烯类药物的过度使用导致了世界范围内的碳青霉烯类耐药和多重耐药问题[4]。

多黏菌素是20世纪40年代发现的一组阳离子多肽类抗生素,对大多数革兰阴性细菌具有快速杀菌作用,是抗多耐药革兰阴性菌最有效的抗生素。随着XDR-AB的检出率逐年增加,多黏菌素已成为治疗XDR-AB感染的最后一道屏障[5]。同时,根据2016年美国感染病学会医院获得性和呼吸机相关性肺炎指南推荐[6],对碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌感染推荐静滴多黏菌素类药物,并建议辅助雾化吸入多黏菌素E。因此,目前推荐多黏菌素作为XDR-AB感染的一线疗法。然而,由于耐药性的发展和不良反应,单用多黏菌素治疗AB感染的问题也越来越多[7]。

首先,多黏菌素单药治疗产生耐药性是难以避免的,而以多黏菌素为基础的联合治疗是防止耐药性产生的有效途径之一[8,9]。其次,多黏菌素经验单一疗法是AB感染30 d死亡率的独立危险因素[10]。因此,当耐药率较高时,目前建议用联合治疗替代单药治疗[10]。再次,大量体外研究显示,多黏菌素联合其他抗生素在许多AB菌株中显示出协同作用,可增强抗菌活性,并通过动物研究表明可降低死亡率,如多黏菌素与亚胺培南、利福平、氯霉素、磷霉素、舒巴坦联用时均观察到显著的协同作用[11-16]。最后,联合疗法可获得显著的微生物学获益,联合治疗的微生物清除率显著高于单药治疗[16-19]。虽然目前没有强有力的证据表明以多黏菌素为基础的联合疗法优于单一疗法,但考虑到更好的微生物清除率,我们需要做更多的体内外实验以筛选出潜在的强效联合方案。因此,本课题通过体外联合药敏实验,探讨以多黏菌素为基础的两药联合方案对XDR-AB的体外抗菌活性,从而为临床治疗XDR-AB感染的提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集2016-01～2017-03我院检验科临床送检标本中分离鉴定的非重复AB菌株30株。所有菌株经分离纯化,VITEK全自动细菌鉴定仪及K-B法鉴定为XDR-AB。本次实验中测定的抗菌药为:替加环素、亚胺培南、头孢吡肟、头孢曲松、头孢他啶、阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素、米诺环素、头孢哌酮/舒巴坦、氨苄西林/舒巴坦、左氧氟沙星、环丙沙星。所选30株菌株对上述除多黏菌素、替加环素外所有抗菌药均耐药。质量控制菌株:鲍曼不动杆菌19606(西安交通大学第二附属医院检验科提供)。

1.1.2 培养液及培养基 血琼脂培养基;Mueller-Hinton(MH)肉汤。

1.1.3 抗菌药物 多黏菌素(LLKJ-TUCQ)、利福平(7823010250)、亚胺培南(85721-33-1)、舒巴坦(C1731069)、替加环素(C10105463)、米诺环素、磷霉素(0350-200001)、氯霉素(7731010130)均购于中国食品药品检定研究所。

1.1.4 主要实验器材及设备 Vitek-2细菌全自动鉴定仪(法国梅里埃生物公司)、麦氏浊度计、比浊仪、96孔平板(国产)、微量加样器及配套枪头等。

1.2 方法

用微量肉汤稀释法分别检测多黏菌素、利福平、亚胺培南、舒巴坦、替加环素、米诺环素、磷霉素、氯霉素对XDR-AB的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),并应用棋盘法检测了多黏菌素分别联合上述7种抗菌药物两两联合的部分抑菌浓度(fractional inhibitory concentration,FIC),计算出部分抑菌浓度指数(FICI)。

1.2.1 微量肉汤法测定MIC MIC测定是将细菌与系列稀释的抗菌药物共同孵育18-24 h,观察能抑制细菌生长的最低浓度。用微量肉汤倍比稀释法测定30株AB对8种抗菌药的MIC,实验操作及结果判断标准参照2016年版CLSI标准[20]。

1.2.2 棋盘法测定FIC并计算FICI 棋盘法设计:经过前述实验已经测定了各抗菌药对各株XDR-AB菌株分别的MIC。按各单药MIC,确定联合药敏试验的药物稀释度,一般选择6-8个稀释度[21-23]。

1.2.2.1 抗生素配制 抗菌药物溶液制备参照2016版CLSI执行标准。根据抗菌药物说明书,计算各种药物有效成分。每种药物选择CLSI推荐的合适的溶解剂,稀释剂采用灭菌生理盐水,储存浓度均为5 120 μg/ml。利福平、环丙沙星、亚胺培南、替加环素、多黏菌素均用前配制。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60 ℃以下环境,保存期不超过6个月。

1.2.2.2 制作含药96孔板 抗菌药倍比稀释至浓度梯度为160MIC,80MIC,40MIC,20MIC,10MIC,5MIC,2.5MIC以及0 μg/ml。其中一种抗菌药物由左向右横向顺序添加,浓度依次递减(每列8个孔的药物浓度相同);另一种抗菌药物由上至下纵向顺序添加,浓度依次递减(每行8个孔的药物浓度相同),各10 μl。加药完毕,用封口膜密封,冻存至-20 ℃冰箱中备用。

1.2.2.3 接种菌悬液配制 直接用接种环挑取生长良好、边缘平滑、形态相似的4-5个单菌落,用2-3 ml灭菌生理盐水调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液,即接种菌悬液。722型分光光度计测定菌液比浊度,即光密度值(OD值)为吸光度在600 nm光波长时0.5,此时菌液浓度为0.5McFarland[约含菌(1-2)×108CFU/ml](直接菌悬液法)。后用MH肉汤1 ∶200稀释,得到终浓度为(5-10)×105CFU/ml的菌液备用。

1.2.2.4 加入菌液 取稀释好的菌液180 μl,应用微量加样枪注入含药96孔板中。各抗生素的最终浓度梯度为8MIC,4MIC,2MIC,1MIC,0.5MIC,0.125MIC以及0 μg/ml,置于37 ℃温箱中过夜培养,18-24 h观察结果。

1.2.2.5 结果判读及质控 棋盘法联合药敏测试结果,96孔平板每行每列中以微孔中液体澄清的最低浓度为两药联合MIC,计算FICI并取平均值。FICI=MICA药联用/MICA药单用+MICB药联用/MICB药单用。判读标准:FICI≤0.5:协同作用;0.5

2 结果

2.1 MIC测定结果

微量肉汤稀释法分别检测多黏菌素、利福平、亚胺培南、舒巴坦、替加环素、米诺环素、磷霉素、氯霉素对XDR-AB的MIC,结果见表1。所筛选出的30株XDR-AB菌株中,对多黏菌素、替加环素的耐药率为0,对利福平的耐药率为83%(25株),对磷霉素和氯霉素的耐药率为100%,对舒巴坦的耐药率为40%(12株)。

表1 30株XDR鲍曼不动杆菌对8种抗生素的MICTable 1 Minimal inhibitory concentration of 30 strains of XDR-AB against 8 antibiotics

2.2 联合药敏实验测定结果

对于本实验中30株临床分离的XDR-AB菌株,多黏菌素与7种抗菌药物联合均以协同及相加作用为主,除替加环素外,无拮抗作用(见表2)。

3 讨论

AB是不动杆菌属中最常见的菌种,也是医院相关感染的重要病原体之一,其检出率逐年增加,该菌对于大多数抗菌药物的耐药率均在50.0%以上,且耐药率有逐年增高的趋势。多黏菌素已成为XDR-AB感染治疗的最后一道防线。然而,随着多黏菌素的广泛使用,其耐药性的产生是不可避免的,我们面临着对耐药AB感染无药可用的风险,而抗生素联合疗法可降低耐药性,提高抗生素的效率。本次实验通过体外联合药敏实验,探究了以多黏菌素为基础的的联合方案对XDR-AB菌株的体外抗菌活性,为联合治疗XDR-AB感染提供了实验依据。临床上治疗由XDR-AB引起的重症感染,可根据药敏实验结果试用以多黏菌素为基础的联合疗法。

表2 多黏菌素分别与7种药物组合的联合抗菌效应Table 2 The in vitro activity of colistin-based combination therapy

3.1 多黏菌素+碳青霉烯类

研究显示多黏菌素联合亚胺培南或美罗培南对AB分离株具有协同作用,其中大多数分离株是对多黏菌素敏感的[15]。Micheline等[9]的研究亦表明,使用棋盘法、E-test法和时间-杀菌曲线三种方法研究多黏菌素与碳青霉烯类药物组合的作用时,组合实验的结果显示出非常高的协同效应率。时间-杀菌曲线测定提供了关于组合的更准确的数据,能够检测杀菌活性和细菌再生长,时间-杀菌曲线研究结果表明,多黏菌素与碳青霉烯类组合可阻止细菌再生长[9]。本实验中,30株XDR-AB菌株对亚胺培南均耐药,通过棋盘法联合药敏实验表明,多黏菌素联合亚胺培南可增强抗菌活性,并以协同及相加作用为主,协同率为80%,相加作用率为17%,未观察到拮抗作用。

3.2 多黏菌素+氯霉素

本次实验中,所选XDR-AB菌株对氯霉素均耐药,但多黏菌素联合氯霉素后,抗菌活性增强。联合药敏实验表明,多黏菌素联合氯霉素的协同作用率为30%,相加作用率为67%,无相关作用占3%,未观察到拮抗作用。研究表明,虽然氯霉素对XDR-AB分离株缺乏体外活性,但多黏菌素与氯霉素组合对XDR-AB菌株显示出协同效应和增强的细菌杀伤作用,也显著延缓了再生长,抑制了多黏菌素耐药的出现[29]。此外,氯霉素另一个重要的优点是肾毒性小或几乎无肾毒性。

3.3 多黏菌素+舒巴坦

本次实验数据表明,多黏菌素联合舒巴坦相加作用率为60%,无相关作用率为40%,未发现协同作用及拮抗作用。与本次实验结果不同的是,Kempf等[11]报道了多黏菌素与舒巴坦组合对多黏菌素耐药AB菌株的体外协同活性,并建议使用多黏菌素与舒巴坦联合疗法以避免多黏菌素耐药AB菌株的出现。

3.4 多黏菌素+利福平

大量观察性及回顾性研究结果表明,多黏菌素+利福平组合对碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌引起的呼吸机相关肺炎是安全有效的,治愈率为50%-70%,并且没有严重的不良反应[27]。在大多数研究中,多黏菌素与利福平联合对于多耐药鲍曼不动杆菌显示100%的协同作用,并通过动物研究表明可降低死亡率[8,14]。但本次棋盘法联合药敏实验表明多黏菌素与利福平联合以相加作用为主(90%),未发现协同作用及拮抗作用。可能有以下两个方面原因:第一,可能与实验样本数量少有关,可增大样本量进一步实验。第二,可能与AB对利福平耐药所致。研究表明,AB对利福平耐药性的增加可降低二者联用的协同作用[27]。

3.5 多黏菌素+磷霉素

本实验30株XDR-AB菌株对磷霉素均耐药,但多黏菌素与磷霉素联合后以协同及相加作用为主,抗菌活性增强。研究表明,在磷霉素单药治疗时,耐药性发生率为100%,而磷霉素与多黏菌素联合使用后降至69.2%,虽然磷霉素对AB表现出较差的活性,但是多黏菌素加磷霉素的组合对AB以协同或相加作用为主[12]。

3.6 多黏菌素+替加环素

本研究通过棋盘法联合药敏实验表明,多黏菌素联合替加环素在3%菌株中表现出协同作用、40%为相加作用,36%为无关作用,20%为拮抗作用。Gurjar等[30]的研究亦表明,多黏菌素与替加环素组合并没有表现出良好的协同作用。另有研究表明,替加环素耐药菌株的总体协同作用率(24.7%)略低于敏感菌株(27.9%),这可能与耐药菌株中外排泵的过度表达降低细胞内抗生素浓度有关,从而导致较低的协同作用率[31]。多项体外研究表明,多黏菌素与替加环素组合表现出较差的协同作用率,多黏菌素联合替加环素对鲍曼不动杆菌的体外作用以无关作用及拮抗作用为主。同时,我们的研究结果亦表明替加环素与多黏菌素组合的协同作用率低,不足以使其成为最佳的联合选择。因此,在这种情况下,对于XDR-AB感染,多黏菌素与替加环素的联合疗法应谨慎选择。

3.7 多黏菌素+米诺环素

本次棋盘法联合药敏实验表明,多黏菌素与米诺环素联合表现为协同作用占40%,相加作用占50%,无相关作用占10%,无拮抗作用出现。关于多黏菌素联合米诺环素对AB的体外抗菌活性的相关研究,目前仍较少,因此应进一步研究。

多黏菌素是治疗XDR-AB感染的最后一道防线,以多黏菌素为基础的联合治疗可显著抑制耐药性的发展并增强的多黏菌素抗菌活性[32]。抗菌药物联合疗法是治疗XDR-AB感染的有效方案,而使用联合抗菌治疗的基础是药物间的相互协同作用。多黏菌素对细菌脂质结构发挥洗涤剂样作用,从而破坏细菌细胞壁,导致细胞壁破裂,允许其他抗生素渗透并破坏诸如外排泵之类的结构[4]。这可能是含多黏菌素的抗菌药物组合发挥协同作用的机制,同时也是评估联合疗法临床有效性的基础。

总之,面对世界范围内增加的XDR-AB感染,由于抗生素选择有限,多黏菌素已成为治疗XDR-AB感染的最后一道防线。目前,尽管大多数XDR-AB分离株对多黏菌素具有较高的敏感性,但多黏菌素单药治疗出现耐药性是难以避免的。含多黏菌素的联合方案可获得潜在的协同效应并防止异质性耐药菌株的选择。本研究通过体外联合药敏实验,多黏菌素联合利福平、亚胺培南、舒巴坦、米诺环素、磷霉素、氯霉素对XDR-AB均以协同及相加作用为主,表明具有良好的抗菌活性。因此,为了提高临床治愈率并抑制耐药菌株的产生,以多黏菌素为基础的联合疗法有望成为XDR-AB感染的推荐治疗方案之一。

本实验尚存在一定的限制:第一,临床菌株的样本量小,且菌株均来自同一医院,可能会影响实验结果,可进一步扩大样本量及样本来源进行实验。第二,体外结果可能不直接用于临床实践,因为在体内条件如动态药物浓度、细菌毒力和感染部位的宿主免疫应答在体外不能完全模仿。因此,在将这些组合应用于临床实践之前,需要对更详细的机制、药效学以及临床试验进行研究,并且应仔细评估肾毒性的风险。