CEACAM-1和MMP-2在结直肠癌中的表达及与淋巴结转移的关系

陶晓峰,张 明,杨 东,郜广明,武雪亮

(1河北省吴桥人民医院普通外科,吴桥 061880;2河北北方学院附属第一医院普外科)

结直肠癌是临床常见恶性肿瘤之一,病死率较高,这不仅与缺乏有效的早期诊断方面的生物学指标有关,还与肿瘤的浸润和转移有关[1]。淋巴结转移是肿瘤发生转移的重要途径,是影响患者术后生存的重要因素之一,结直肠癌是富于微淋巴管的肿瘤,间质的微淋巴管生成是结直肠癌生物学进展的重要因素[2]。微淋巴管密度(lymphatic microvessel density,LMVD)作为微淋巴管新生能力的重要指标,能够反映恶性肿瘤的进展程度。癌胚抗原相关细胞黏附分子-1(CEACAM-1)也称CD66,其在肿瘤中具有促进癌变发生、进展的作用,还具有多种恶性生物学行为,如诱导微淋巴管的生成等[3]。基质金属蛋白酶2(MMP-2)是经典的淋巴管生成促进因子,可以促进间质微淋巴管生成。D2-40是高表达的淋巴管特异性标记,在所有淋巴管内皮细胞标志物中特异性最高[4]。本研究采用免疫组织化学法,检测结直肠癌、正常结直肠组织中CEACAM-1和MMP-2的表达,同时采用D2-40标记结直肠癌组织中LMVD,分析CEACAM-1、MMP-2在结直肠癌中的表达情况及与LMVD的关系和临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集2015-01～2016-12河北省吴桥人民医院普通外科手术切除的原发性结直肠癌组织50例、正常组织50例,癌组织取自癌灶中心处,另取标本残端切缘经病理证实为正常肠组织(来源相同)。术前未行新辅助放化疗等针对性治疗。

1.2 免疫组化染色方法及试剂

兔抗人单克隆浓缩型CEACAM-1抗体、鼠抗人浓缩型MMP-2单克隆抗体均购于英国Abcam公司;D2-40抗体购于美国Abnova公司。

10%甲醛溶液固定部分标本,并用石蜡包埋,切片厚度为4 μm。使用苏木精-伊红(HE)染色方法,病理诊断。切片经过80 ℃烤箱烤片30 min,乙醇脱水,灭活内源性过氧化物酶,枸橼酸缓冲液高温高压水化修复;PBS洗3次,加一抗,4 ℃过夜;PBS洗3次,加二抗。室温下使用DAB显色试剂显色,根据显微镜下观察的显色情况控制显示时间,苏木精轻度复染,并用1%的盐酸乙醇分化5 min、流水冲5 min、梯度乙醇脱水(80%,85%,90%,95%,100%)及松节油透明5 min,最后树胶封片。阴性对照为PBS代替一抗。

1.3 CEACAM-1、MMP-2阳性判定标准

CEACAM-1和MMP-2均以细胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性表达,根据着色细胞占视野细胞总数的百分比及着色细胞染色强弱评分,≤5%为0分,6%-25%为1分,26%-50%时为2分,51%-75%时为3分,>75%时为4分;无着色为0分,浅黄色为1分,黄色为2分,深黄色为3分;两者相乘,0分为(-),1-4分为(+),5-8分为(++),9-12分为(+++),(+)-(+++)均视为阳性。

1.4 微淋巴管密度检测

应用D2-40抗体标记染色于肿瘤淋巴管内皮细胞的胞质,以孤立的棕黄色内皮细胞或内皮细胞簇团作为一个微淋巴管并计数;先在40倍光镜下选出4个脉管最密集的区域,然后在400倍显微镜下观察着色的内皮细胞簇和单个内皮细胞标记为微淋巴管,随机计数5个视野的微淋巴管数,取平均值作为组织的LMVD。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 免疫组化检测CEACAM-1和MMP-2在结直肠癌中的表达

CEACAM-1在结直肠癌组织中的阳性表达明显高于正常组织中的阳性表达,差异有统计学意义(P=0.000);MMP-2在结直肠癌组织中的阳性表达明显高于正常组织中的阳性表达,差异有统计学意义(P=0.000);结直肠癌组织中LMVD表达值明显高于正常组织中值,差异有统计学意义(P=0.000,见表1)。

表1 CEACAM-1、MMP-2、LMVD在结直肠正常组织与癌组织中的表达Table 1 Expression of CEACAM-1,MMP-2 and LMVD in colorectal normal tissues and cancer tissues

2.2 CEACAM-1和MMP-2蛋白的表达水平及LMVD值与临床病理参数间的关系

CEACAM-1、MMP-2和LMVD的表达水平均与肿瘤浆膜浸润、TNM分期、淋巴结转移、肝转移及脉管浸润相关(均P<0.01),而与肿瘤大小、分化程度无关(均P>0.05,见表2)。

表2 CEACAM-1和MMP-2及LMVD在结直肠癌组织中的表达与临床病理因素的关系Table 2 Relationship between the expression of CEACAM-1,MMP-2 and LMVD in colorectal cancer and the clinicopathologic factors

2.3 CEACAM-1和MMP-2在结直肠腺癌组中的表达与LMVD的相关性

结直肠癌中CEACAM-1阳性者与CEACAM-1阴性者LMVD值分别为18.14±3.71和10.20±3.52(t=16.510,P<0.05),结直肠癌中MMP-2阳性者与MMP-2阴性者LMVD值分别为17.19±3.85和10.09±3.08,差异有统计学意义(t=14.187,P<0.05)。

2.4 CEACAM-1和MMP-2在结直肠癌中表达的相关性

CEACAM-1和MMP-2在正常组织中细胞排列规整,染色均匀,而在癌组织中排列紊乱,失去正常形态,且染色集中于细胞浆,呈棕黄色(见图1，2)。二者在结直肠癌中的表达呈明显的正相关关系(r=0.489,P<0.001,见表3)。

A.正常组织 B.癌组织

A.正常组织 B.癌组织

表3 结直肠癌组织CEACAM-1和MMP-2表达的相关性Table 3 Correlation between CEACAM-1 and MMP-2 expression in colorectal cancer tissues

3 讨论

近年来CEACAM-1在肿瘤发生进展中的作用备受关注,CEACAM-1是一种跨膜糖蛋白,属于癌胚抗原家族及免疫超蛋白家族黏附分子之一,最初由Okegawa等[5]在研究木瓜蛋白酶不溶性质膜成分对细胞膜表面蛋白抗体细胞聚集抑制功能中和作用时发现。CEACAM-1基因位于染色体19q13.2区,由9个外显子组成,根据不同的剪接模式可产生11个亚型。其中8个亚型的蛋白结构包括细胞外1个N-末端IgV样结构域、0-3个IgC2样结构域、1个保守的跨膜区域和1个胞内段,根据胞内段的长短可分为CEACAM-1-L和CEACAM-l-S两个亚组[6]。CEACAM-1-L胞内段含有2个免疫受体酪氨酸抑制基序通过其磷酸化参与细胞内信号转导,发挥抑制下游信号的作用,而CEACAM-l-S则无此基序,但含有结合钙调蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白的结构域,对细胞骨架有调节作用。在细胞表面CEACAM-1-L主要以一种顺式同源二聚体的形式存在,不同活化状态下的细胞二聚体不同,可能参与不同的信号调节通路,CEACAM-1-L还可以在细胞间形成反式二聚体,介导细胞间黏附。随后的研究发现CEACAM-l除了介导细胞黏附外,还参与了调节细胞增殖、凋亡、分化,胰岛素代谢,血管淋巴管新生,免疫调节等病理生理过程。申宝鸣等[7]报道大肠癌患者血清CEACAM1水平明显高于正常组,认为CEACAM-1可能是早期诊断大肠癌的指标。

MMP-2能够降解Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原及层粘连蛋白、蛋白聚糖等,诱导肿瘤细胞突破基底膜致其浸润,而且能促进肿瘤微淋巴管的形成,加速淋巴转移。大量研究表明MMP-2在多种恶性肿瘤组织和肿瘤细胞系中均呈高表达状态,体外侵袭实验也证实肿瘤细胞的高侵袭转移能力与MMP-2的过表达密切相关[8]。

肿瘤的转移和生长与其淋巴管的生长有着重要联系,而肿瘤微淋巴管的生长受到多种因子的调节控制,CEACAM-1可能是初始调节因子,CEACAM-1的表达可直接控制微淋巴管生成,也可以刺激MMP-2的生成,而MMP-2不仅可以直接调节微淋巴管新生,还可以通过其他相关通路调控微淋巴管,例如通过ST2/cNOS信号通路刺激内源性NO生成,从而使微淋巴管生长增加,同时增强其淋巴管壁通透性,使肿瘤微淋巴管密度增加。Yurdakul等[9]研究显示,CEACAM-1在肿瘤组织的淋巴管内皮中常有表达,认为其是肿瘤新生淋巴管的标志物。Horst等[10]的小鼠模型实验论证了在调节微淋巴管重建的过程中,内皮细胞上的CEACAM-1表达起到了重要作用,相反基质胶阻塞实验及后肢缺血模型的新生毛细淋巴管重建的失败正是由CEACAM1的缺少造成。CEACAM-1在肿瘤细胞内表达增多时,会导致CEACAM-1在淋巴液中增多,通过淋巴液与血液交换,使CEACAM-1在血液中结合白细胞表面受体,作用于游离癌细胞ICAM-1/LFA,使局部无菌炎症因子释放,内皮细胞和中性粒细胞聚拢,故游离癌细胞脱离免疫监控,进而肿瘤远处转移发生和加强。

本研究显示:CEACAM-1和MMP-2在结直肠癌组织中表达明显高于正常组织,且与肿瘤的浆膜浸润、TNM分期、淋巴结转移、肝转移及脉管浸润密切相关,支持CEACAM-1和MMP-2促进肿瘤恶性生物学进程的理论。结直肠癌组织中LMVD表达明显高于癌旁正常组织,CEACAM-1和MMP-2在结直肠癌中的表达具有正相关性,同时CEACAM-1和MMP-2在结直肠癌中的表达与LMVD也存在明显的正相关性。

总之,CEACAM-1的异常表达参与结直肠癌的发生演进,并与淋巴结转移等恶性生物学行为密切相关,其机制可能为CEACAM-1诱导MMP-2的表达从而促进肿瘤新生淋巴管的生成。因而,研制抑制CEACAM-1的靶向药物将有望成为治疗结直肠癌的重要基因手段。