ICP-AES法测定麻杏石甘汤杏仁剂量变化对微量元素的影响

张五萍,寇 光,饶 毅,魏惠珍,伍锡栋

(1江西省人民医院药学部,南昌 330006;2中药固体制剂制造技术国家工程研究中心;3江西省医疗器械检测中心;*通讯作者,E-mail:wuxidong1986@163.com)

麻杏石甘汤出自张仲景的《伤寒论》,由麻黄、杏仁、石膏、甘草组成。广泛用于平喘、止咳、解热。临床中需随证施量[1]。杏仁具有降气止咳平喘,润肠通便的功效,用于咳嗽气喘,胸满痰多,肠燥便秘[2]。用药目的偏为镇咳平喘时,则通常会改变杏仁的用量,以期达到治疗最优化。除有机成分外,微量元素同样是其发挥药效的重要组成部分[3-5]。杏仁剂量变化对有机成分变化前期已有研究[6],但对麻杏石甘汤中微量元素的溶出有什么影响尚不明确，本文通过对方中杏仁用量进行增减,固定其他药材的剂量,采用电感耦合高频等离子体原子发射光谱(ICP-AES)法测定其水煎液中钙(Ca)、镁(Mg)、铁(Fe)、锰(Mn)和铜(Cu)元素溶出总量的变化,探讨随证施量中改变杏仁剂量对微量元素溶出的影响,为其用量提供理论参考。

1 仪器与材料

Optima-5300DV型等离子体发射光谱仪(美国PerkinElmer公司);KDM电热套(山东鄄城赛科仪器设备厂);CLXXUVFM2超纯水器(威立雅集团上海公司);高氯酸(HClO4)优级纯(金鹿化工有限公司);硝酸(HNO3)优级纯(西陇化工有限公司);Ca(批号178044-3)、Mg(批号177004-1)、Fe(批号167026-1)、Mn(批号172039-1)、Cu(批号175035-2)标准液,均由国家有色金属及电子材料分析测试中心提供,规格均为1 000 μg/ml,临用时用1% HNO3(体积分数)配制成应用液。

2 方法与结果

2.1 实验设计

在原方的基础上,固定麻黄、石膏、甘草三味药材的剂量,杏仁剂量逐渐递减、递增1.5倍各设4个剂量组,再设一个空白剂量组,共10个剂量组,加入方剂总量的8倍水(纯净水)进行煎煮。另设单味药材组,按照原方剂量和加水量对各单味药材煎煮。通过测定水煎液中Ca、Mg、Fe、Mn和Cu 5种微量元素的溶出总量,具体用量见表1。

2.2 汤剂的制备

2.2.1 杏仁剂量变化组 按照表1不同组方称取药材。将麻黄、石膏入水,称重,加热至沸腾,开始计时,改为文火煎煮30 min,再加入甘草、杏仁煎煮40 min。计算煎煮前的总重,补重,趁热过滤,即得麻杏石甘汤杏仁剂量变化水煎液[7]。

2.2.2 单味药材组 按照原方用量称取各单味药材,量取原方组所需水。单味麻黄、单膏饮片水煎组均为单味药材加入水,加热至沸腾,开始计时,然后改用文火煎煮70 min。单味杏仁、甘草饮片水煎组均为水煮沸后,加入单味药材,开始计时,改为文火煎煮40 min。计算煎煮前的总重,补重,趁热过滤,即得单味药材水煎液。

2.3 供试品的制备

精密量取水煎液10 ml,加入HNO3/HClO4(4 ∶1)混合酸10 ml,电热套加热蒸发至无白烟并液体澄清,冷却后用1% HNO3定容至50 ml。精密量取纯净水10 ml,平行制备空白溶液,待测(所使用的玻璃仪器均在10%硝酸浸泡过夜,并用超纯水清洗),得供试品溶液。同法操作,得试剂空白组。

2.4 样品测定

采用ICP-AES,Ca、Mg、Fe、Mn、Cu分析波长分别为317.933,279.077,283.304,257.610,325.957 nm,对标准溶液进行测试,化学工作站自动绘制校正曲线,确认后进行样品测定。将测定值代入标准曲线中进行计算,求得待测液浓度。将所测值减去试剂空白组即得供试品中微量元素浓度,并计算汤中各微量元素溶出总量,微量元素溶出总量=C(浓度)*V(体积)。

2.5 方法学考察

对各元素进行了方法学指标考察,将Ca、Mg的标准储备液配制成一系列标准溶液,浓度分别为0,0.1,1,10,20,50,100 μg/ml,Fe、Mn、Cu的标准储备液配制成一系列混合标准溶液,浓度分别0,0.1,1,5,10 μg/ml,在选定的仪器操作下对标准工作液进行测定,工作站自动绘制工作曲线,得到各回归方程及相关性。并进行精密度试验、重复性试验、回收率试验,方法学考察结果见表2。

2.6 统计学分析

2.7 样品测定结果

2.7.1 各单味饮片水煎液中微量元素的溶出总量 利用ICP-AES测定单味饮片水煎液中微量元素的溶出总量,结果见表3。麻杏石甘汤中Ca元素主要来源于石膏,Mg元素主要来源于麻黄、甘草,Fe元素主要来源于麻黄、甘草,Mn元素主要来源于麻黄、甘草,Cu元素主要来源于甘草、石膏。

表3 单味饮片水煎液中微量元素的溶出总量 (n=3)Table 3 Amount of trace element in single material decoctions (n=3)

2.7.2 麻杏石甘汤杏仁剂量变化水煎液中微量元素的溶出总量 麻杏石甘汤杏仁剂量变化水煎液中微量元素的溶出总量见表4。对各微量元素与杏仁剂量及加水量相关性进行分析(见表5、图1):其中Ca与杏仁剂量、汤剂加水量呈线性正相关,且回归方程具有统计学意义(P<0.05)。Mg、Fe、Mn的溶出总量与杏仁剂量呈现负相关,且回归方程具有统计学意义(P<0.05)。Cu的溶出总量与杏仁剂量变化无关,且回归方程无统计学意义(P>0.05)。

表4 麻杏石甘汤杏仁剂量变化水煎液中微量元素的溶出总量 (n=3)Table 2 Amount of trace element in Maxing Shigan decoction with different almond doses (n=3)

表5 各微量元素溶出总量与杏仁剂量或加水量的相关性Table 5 The correlation between trace element and the dosage of almond or water

3 讨论

据研究报道,麻杏石甘汤中Ca、Mg、Fe、Mn和Cu元素[8,9]在止咳平喘中发挥重要作用。Ca与肥大细胞释放生物介质密切相关,细胞内的Ca含量是维持支气管平滑肌纤维正常舒缩的基本条件,在治疗中起到了重要作用。Mg可拮抗钙离子内流,阻止支气管平滑肌的收缩。减少肥大细胞递质的释放,激活肾上腺素β2受体,使得支气管进行扩张,可舒张痉挛的小动脉和缺氧的毛细血管,改善肺部的前负荷等,同时还可以减轻患者焦虑情况,从多方面发挥平喘作用。Fe可能使cAMP/cGMP比值趋于正常,细胞内cAMP浓度增加,松弛平滑肌,阻止哮喘的发作,还可增强抵抗力,调节呼吸等功效。Mn缺乏可造成细胞免疫功能低下,导致呼吸道的感染,诱发哮喘的发作。Cu是体内氧化物歧化酶的重要元素,缺乏会造成对呼吸道炎症细胞产生活性氧自由基的消除能力降低,对气道上皮细胞有直接广泛性损伤,亦会造成机体免疫力降低,使得患者易发生感染,病情难以好转。因此,探讨杏仁剂量变化对这5种微量元素溶出的影响,对研究临床随证施量中药效物质基础的量效关系具有重要意义。

图1 各微量元素与杏仁剂量/加水量的关系Figure 1 Relationship between trace elements and the dosage of almond or water added

ICP-AES具有多元素同时检测、速度快及准确度高等优点[10]。本实验采用ICP-AES法测定麻杏石甘汤水煎液中Ca、Mg、Fe、Mn、Cu 5种微量元素的含量,具有良好的准确度和精密度。麻杏石甘汤中钙与杏仁剂量、汤剂加水量均呈线性相关,相关性r均为0.992,显著性P均为0.000,说明Ca溶出总量主要受加水量影响。汤中钙主要来源于石膏,而石膏的钙主要来源于CaSO4·2H2O,微溶于水,在汤剂中始终为饱和浓度,据报道石膏煎煮后再粉碎可重新使用[11,12],结合本实验结果提示钙元素的溶出主要受加水量影响,临床中重用石膏时不是单纯为了增加钙的含量。因为如果为了单纯增加钙的含量,通过增加加水量即可。Mg、Fe、Mn主要来源于麻黄药材,次要来源均为甘草,Mg、Fe、Mn的含量随着杏仁药材用药量的增加而减少,与杏仁剂量r分别为0.957,0.944,0.944,P均为0.000,差异具有统计学意义。Cu主要来源于甘草、石膏,Cu含量与杏仁剂量相关性的P>0.05,说明差异无统计学意义。

本课题组前期实验[6]显示随着杏仁剂量的增加,甘草中的甘草苷、甘草酸含量逐渐下降,可能原因是与杏仁中部分成分配伍,从而缓解了杏仁剂量增加引起的副作用。但当杏仁剂量增加到一定程度时,其缓和作用达到平稳。本实验研究显示杏仁剂量增加,引起Mg、Fe、Mn各元素含量的下降,其主要来源为麻黄、甘草药材,故推测其原因为麻黄、甘草中微量元素与杏仁成分发生了配伍而引起。当杏仁剂量增加到一定比例后,配伍作用趋于饱和,Mg、Fe、Mn的减少程度趋于平稳。临床随证施量改变杏仁剂量应权衡利弊,不可无限制地增加杏仁剂量。

本实验麻杏石甘汤中Mg、Fe、Mn的溶出总量随着杏仁剂量的增加而减少。各微量元素的含量与麻杏石甘汤整体药效作用的相关性,进入体内后的变化情况如何,仍有待进一步研究。