miR-197-3p对骨肉瘤MG63细胞生物学行为的影响

宋晓鹏,张 蕾,信 波,李 萌,张立成*

(1解放军第八十八医院肿瘤科,泰安 27100;*通讯作者,E-mail:zhanglc88@aliyun.com)

骨肉瘤是一种主要发生在儿童及青少年的具有高度恶性以及侵袭能力非常强的骨肿瘤,其早期易出现肺转移,预后较差[1]。大约50%的患者在初次就诊时就已伴有远处转移[2]。随着各种联合化疗方案的出现,骨肉瘤患者的5年生存率达到了60%-70%[3]。然而,半数患者对化疗药物具有抵抗性,即使行手术切除及联合化疗治疗后,其仍存在高复发和远处转移风险[4]。骨肉瘤的治疗已经进入瓶颈期,为提高骨肉瘤患者的预后,急需发现新的治疗靶点以及发展新的治疗方案。

miRNAs作为一类非编码的小RNA分子,其广泛参与了人体多种类型肿瘤的发生及发展[5,6]。miR-197-3p作为miRNAs家族中重要的一员,其在包括肺癌、膀胱癌、肝癌和胰腺癌在内的多种肿瘤中过表达,且过表达被认为与肿瘤的发生发展密切相关[7],但miR-197-3p在骨肉瘤中的作用却未见报道。有研究表明,促癌基因APE1在包括骨肉瘤在内的多种肿瘤中表达升高,在骨肉瘤细胞中下调APE1的表达,会导致miR-197-3p表达降低[8]。此研究表明,miR-197-3p在骨肉瘤的进展中很可能起到促进作用。所以综上,本实验在采取抑制骨肉瘤MG63细胞内miR-197-3p的表达后来观察骨肉瘤细胞生物学行为发生的改变,旨在为骨肉瘤的治疗寻找新的有效的治疗靶点。

笔者作为陕西农垦集团朝邑农场有限公司外派到苏垦农发新洋分公司挂职的干部，全程参加了新洋分公司2018年三秋工作。新洋分公司运用现代公司化管理模式，依靠科技创新，落实关键技术措施，发展现代农业。新洋分公司发展现代农业的公司化管理模式，值得陕西农垦借鉴学习。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及设备

DMEM培养基及胎牛血清购于美国Hyclone公司;OPTI-MEMI购于美国Gbico公司;miR-197-3p inhibitor及miR-197-3p NC购于中国上海吉玛制药技术有限公司;Lipo2000TM购于美国Invitrogen公司;CCK-8试剂盒购于美国MCE公司;Annexin Ⅴ-FITC-PI试剂盒购于中国上海翊圣生物科技有限公司;Matrigel基质胶购买于美国BD公司;Transwell小室购于美国Corning公司;Trziol购于中国康为世纪生物科技有限公司;miRNA反转录试剂盒及荧光实时定量试剂盒购于加拿大ABM公司;酶标仪购于瑞士Tecon公司(型号:Infinite M200 Pro);梯度PCR仪购于美国Bio-Rad公司(型号:MyClear PCR);荧光定量PCR仪购于德国Qiagen公司(型号:Rotor Gene Q2 Plex)。

1.2 细胞株、细胞培养

实验所用的MG63细胞购于上海吉凯基因化学技术有限公司。用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养MG63细胞,将细胞置于37 ℃饱和湿度、5% CO2培养和传代。

流式细胞术凋亡检测结果显示,实验组细胞的凋亡率为10.93%±0.32%,较对照组凋亡率(4.03%±0.21%)明显升高(P<0.01,见图5),说明抑制miR-197-3p表达可以促进MG63细胞凋亡,也说明miR-197-3p可以抑制肿瘤细胞的凋亡。

1.3 细胞转染

转染前1 d收集细胞接种于6孔板,确保细胞铺板24 h后细胞汇合度约为30%。根据Lipo2000手册推荐的剂量进行转染,6 h后换回常规培养基。在转染48 h后进行转染效率验证以及细胞功能试验。实验分2组,实验组细胞转染miR-197-3p inhibitor(序列:5′-GCUGGGUGGAGAAGGUGGUGAA-3′),对照组细胞转染inhibitor NC(序列:5′-CAGUACUUU UGUGUAGUACAA-3′)。

1.4 qRT-PCR检测细胞转染效率

用Trziol处理转染后细胞并提取RNA,后续按照miRNA反转录试剂盒及荧光实时定量PCR试剂盒步骤进行。miR-197-3p引物:F:5′-GTTCACCACCTTCTCCAC-3′;R:5′-GTGCAGGGT CCGAGGT-3′。实验重复进行3次,结果以2-ΔΔCt表示。

1.5 CCK-8细胞增殖实验

收集6孔板内转染后细胞,按每孔3 000细胞接种于96孔板,每组设置8复孔,孔板外围复孔填充PBS溶液。分别于铺板后24 h、48 h、72 h和96 h实验组和对照组各取1个96孔板,加入10 μl CCK-8溶液,继续细胞培养箱培养3 h,然后将细胞置于酶标仪,震动1 min,在450 nm波长下测量吸光度值(OD值)。每次实验取8孔平均值,实验重复进行3次。

1.6 Transwell细胞侵袭实验

目前，我国高校开展现代化教育教学活动时，都在不同程度上需要借助现代化的教学资源库平台系统。基于JavaEE系统的高校教育资源库平台的设计，需要对系统的可行性进行分析。从技术设计的角度来说，JavaEE下的高校教学资源库平台系统设计，在实际的研发和设计阶段，对于软件和硬件系统等方面的条件都具有较高的发展要求。为了确保系统的稳定性与可操作性，相关领域的工作人员需要采用B/S架构，对系统进行优化设计。在网页设计阶段，应用JSP+CSS+DIV，结合jQuery对其进行验证，可以充分地提升系统数据库的优化设计效果，增强高校办学能力[1]。

将Matrigel基质胶提前置于4 ℃冰箱,次日以1 ∶8比例稀释基质胶,每小室予以铺胶50 μl,将小室置于细胞培养箱45 min使其凝固。将转染后细胞以每小室5 000细胞接种于小室,小室内采用无血清DMEM培养基,使其终体积在200 μl,小室下24孔板内加入600 μl含20%血清的DMEM培养基,放入细胞培养箱,待48 h后取出小室,以100%乙醇固定5 min,后5%结晶紫染色5 min。随机选取8个视野计算细胞数目,并取均数。每组3个小室,实验重复进行3次。

1.7 Transwell细胞迁移实验

Transwell细胞迁移实验结果同侵袭实验,与对照组比较,实验组穿过小室细胞数明显减少(P<0.01,见图4),说明抑制miR-197-3p作用后,可以抑制MG63细胞的迁移能力,也表明miR-197-3p可以促进肿瘤细胞的迁移。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡

收集转染后细胞,每组3个样本。预冷PBS 2次洗涤后,加入100 μl Binding Buffer将细胞重悬,继续加入5 μl Annexin Ⅴ和10 μl PI,避光常温反应15 min后,加入400 μl Binding Buffer,置于冰上,待检测。实验重复进行3次。

1.9 统计学分析

在MG63细胞转染48 h后,提取两组细胞RNA后进行电泳检测,反转录后进行荧光定量PCR检测。与对照组相比,实验组在转染miR-197-3p inhibitor后,实验组细胞miR-197-3p的表达水平明显降低(P<0.01,见图1),说明转染有效,可以进行后续实验。

2 结果

2.1 细胞转染效果验证

A.电泳图 B.转染效率分析

2.2 miR-197-3p抑制物对MG63细胞增殖能力的影响

CCK-8实验结果显示,转染miR-197-3p inhibitor抑制其表达后,实验组在48 h、72 h和96 h的OD值较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01,见图2)。说明了miR-197-3p确实在骨肉瘤细胞系MG63起着促进增殖作用,通过抑制它的表达可以抑制细胞的增殖能力。

Analysis of Influencing Factors on Fatigue of Offshore Wind Turbine Monopile Foundation WANG Hongqing,LIU Xudong,BI Mingjun,LIU Jinchao(92)

2.3 miR-197-3p抑制物对MG63细胞侵袭能力的影响

Transwell细胞侵袭实验结果显示,实验组穿过小室的细胞数较对照组明显减少(P<0.01,见图3),说明实验组转染miR-197-3p抑制其表达后,其细胞的侵袭能力降低,间接说明miR-197-3p可以促进MG63细胞的侵袭能力。

与Inhibitor NC组相比,*P<0.01

图3 miR-197-3p抑制物对MG63细胞侵袭能力的影响 (×200)Figure 3 Effect of miR-197-3p on the invasion of MG63 cells (×200)

2.4 miR-197-3p抑制物对MG63细胞迁移能力的影响

将转染后细胞以每小室5 000细胞接种于小室,小室内不铺Matrigel基质胶,小室内采用无血清DMEM培养基,使其终体积200 μl,小室下加入600 μl含20%血清的DMEM培养基,放入细胞培养箱,待36 h后取出小室,后续步骤同侵袭实验。

对于摩擦作用对材料变形的影响，已有不少学者做了研究。李达人等[7]通过数值模拟方法确定了W-40%Cu粉末烧结材料在热加工数值模拟过程中的摩擦因子。邓华红等[8]通过数值模拟研究了叶片精锻过程中摩擦的作用，发现摩擦对温度场和载荷形成曲线均有较大影响。马勇等[9]采用有限元软件分析了不同摩擦条件对7075铝合金等通道角挤压过程的影响，发现随着摩擦因数增大，载荷峰值明显增大甚至成倍增长，且载荷值波动加剧，等效应力应变分布不均匀。本文结合Deform 3D有限元软件，研究了摩擦系数对2024铝合金的热模拟压缩过程的影响。

2.5 miR-197-3p抑制物对MG63细胞凋亡的影响

LRH-250CL低温生化培养箱，上海一恒科学仪器公司；3k15高速冷冻离心机，美国 Sigma公司；FD5-Serious真空冷冻干燥机，GOLD SIM仪器公司；SPARK酶标仪，瑞士TECAN仪器公司；K9860全自动凯氏定氮仪，济南海能仪器公司；哈西多功能 pH计，上海哈西分析仪器有限公司。

图4 miR-197-3p抑制物对MG63细胞迁移能力的影响 (×200)Figure 4 Effect of miR-197-3p on the migration of MG63 cells (×200)

图5 miR-197-3p抑制物对MG63细胞凋亡的影响Figure 5 Effect of miR-197-3p on the apoptosis of MG63 cells

3 讨论

miRNAs作为一类约18-25核苷酸大小的非编码小RNA分子,可扮演类似致癌基因或肿瘤抑制癌基因的角色,miRNAs通过参与调节肿瘤细胞的增殖、转移和凋亡等生物学行为,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[6]。

本研究通过CCK-8细胞增殖实验证实,通过抑制骨肉瘤MG63细胞内miR-197-3p的表达,可以抑制肿瘤细胞的增殖能力,说明miR-197-3p在骨肉瘤中扮演癌基因角色。在其他类型的肿瘤中,miR-197-3p被报道可以促进肾母细胞瘤和甲状腺癌细胞的增殖,同样扮演癌基因角色[9,10]。此外,miR-197-3p也有被报道作为抑癌基因抑制细胞增殖,例如在胶质母细胞瘤中,miR-197-3p通过作用于靶基因GAB2抑制肿瘤细胞增殖[11]。也有报道显示miR-197-3p在结直肠癌及肺癌细胞系中对细胞增殖没有明显影响[12,13]。由此可见,miR-197-3p在不同类型的肿瘤中发挥作用不同,其具体机制有待于进一步研究。

发生转移是肿瘤进展中的重要事件,直接影响患者的预后,因此,关于肿瘤转移机制的研究也一直是重点。其中,上皮间质细胞转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)更是近些年转移机制研究的热点。研究表明,miR-197-3p可诱导胰腺癌细胞发生EMT,进而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移[14]。我们通过Transwell实验也证实miR-197-3p可以促进骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移,与上述研究结果一致,但miR-197-3p在骨肉瘤中促转移的具体作用机制有待进一步研究。此外,在肝细胞癌和甲状腺癌中,miR-197-3p都被证实可以提高肿瘤细胞的侵袭和迁移能力,它是通过作用于转移相关靶基因来发挥转移促进作用[15,16]。

肿瘤的发生发展与细胞凋亡异常有密切关系,细胞凋亡抑制将加速肿瘤进展。本研究通过流式细胞检测证实,抑制miR-197-3p的表达可以抑制骨肉瘤MG63细胞凋亡。此外,在肺癌中,miR-197-3p可通过抑制抑癌基因P53的表达来实现凋亡抑制作用[17]。另一项研究表明,抑制miR-197-3p的表达,可促进肺癌细胞凋亡,同样表明了miR-197-3p的凋亡抑制作用[18]。但miR-197-3p也可促进细胞凋亡,例如在子宫肌瘤中,miR-197-3p在肿瘤组织中表达下降,上调miR-197-3p的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡[19]。由此说明,miR-197-3p对细胞凋亡的调控作用因肿瘤类型不同而异。miR-197-3p在骨肉瘤中的凋亡抑制具体作用机制有待于进一步研究。

miR-197-3p与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡密切相关,且在多种类型肿瘤中发挥癌基因作用,因此对肿瘤细胞的miR197-3p表达进行干预,为肿瘤治疗提供新的思路。

DNA条形码技术可以直接从基因水平提供鉴定依据，将有助于非分类学专业工作者对中药用植物进行快速、准确地鉴定，是传统鉴定方法的补充和拓展，具较好的推广和应用价值[24]。本研究结果分析了DNA条形码技术应用于中药用植物鉴定中被广泛关注的问题，证明了ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别滨海白首乌药用植物，为保障临床安全用药提供有效手段，也为萝藦科植物分子鉴定和遗传多样性研究奠定了基础。

本研究结果表明抑制miR-197-3p的表达,可以抑制骨肉瘤MG63细胞的增殖、侵袭、迁移,促进肿瘤细胞凋亡,在体外细胞实验证实了miR-197-3p在骨肉瘤中的促肿瘤作用。虽然其具体的作用机制以及下游的靶基因尚需进一步研究,但本研究为骨肉瘤的治疗提供了新的途径。