小檗胺对异丙肾上腺素致小鼠心肌肥厚的保护作用

马文帅,郭万刚,艾永飞,马 超

(空军军医大学唐都医院心血管内科,西安 710038;*通讯作者,E-mail:chaomaafmu@126.com)

病理性心肌肥厚是心脏对衰老、心肌缺血、高血压等多种生物力学和生理病理刺激的反应[1]。起初,这些生理或病理状态所产生的心脏负荷会刺激心肌细胞合成一些蛋白质,以提高心输出量来适应机体的需要,这一过程被称为代偿性心肌肥厚[2]。持续的心肌肥厚会导致心肌耗氧量显著增加,继而出现渐进性的间质细胞转化和心肌细胞死亡,加速了心肌组织纤维化进程和心脏功能的恶化,最终可引起心力衰竭、猝死或中风等严重后果[3,4]。因此,积极有效地预防和治疗病理性心肌肥厚具有重要的临床意义。

研究报道一种从伏牛花的根、茎和树皮中提取的双苄基异喹啉生物碱小檗胺(berbamine,BBM),在心血管药理学方面发挥着重要的保护作用[5]。BBM不仅对大鼠心脏有着一定的正性肌力作用,还被大量文献证实具有抗心律失常、抗心肌缺血、抗血栓形成以及舒张血管降低血压和减慢心率等作用[6,7],但小檗胺是否能抵抗心肌肥厚的发生发展尚无相关报道。因此,本研究拟采用皮下注射异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)的方法来构建小鼠心肌肥厚模型,以观察小檗胺对心肌肥厚的治疗作用并初步探讨其潜在的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

8周龄雄性C57BL/6小鼠60只,清洁级,体质量20-25 g,购于空军军医大学动物实验中心,动物生产许可证号:SCXK(军)2007-007号。小檗胺(BBM)、二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)荧光探针和异丙肾上腺素(ISO)购自美国Sigma公司。反转录试剂盒及RT-PCR试剂盒购自日本Takara公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、肌球蛋白重链β(myosin heavy chain-β,β-MHC)、胶原蛋白1(Collagen-1)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)和NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,Nox4)抗体购自美国Abcam公司,磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体购自北京中杉公司。

1.2 动物分组及处理

将60只雄性8周龄C57BL/6小鼠随机分为4组:对照组、BBM组(单纯药物处理组)、ISO组(心肌肥厚模型组)和BBM+ISO组(心肌肥厚模型+药物处理组),每组15只。BBM组和BBM+ISO组给予BBM(100 mg/kg,0.6 ml)灌胃处理14 d,每天一次,对照组和ISO组给予相同体积的生理盐水灌胃处理14 d,每天一次。ISO组和BBM+ISO组在第8天时给予ISO(5 mg/kg,0.5 ml)皮下多点注射,连续7 d,每天一次,以构建小鼠心肌肥厚模型,对照组和BBM组在第8天时给予皮下相同体积生理盐水多点注射,连续7 d,每天一次,且皮下注射均在灌胃处理前进行。

1.3 心功能测定

异氟烷吸入麻醉小鼠,脱毛固定于恒温小动物心脏超声检测平台上,待心率稳定后(400-500次/min),用Vevo 770小动物超声仪记录M型超声图像,测量小鼠左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)、左室收缩末期内径(left ventricular end-systolic dimension,LVESD),并用软件计算相应的左室射血分数(left ventricular ejection,LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.4 心肌组织学指标测定

各组小鼠心功能检测结束后测定其体质量,待体质量测定完成后立即脱颈处死,取小鼠心脏及右下肢胫骨并用PBS漂净,用滤纸上吸去表面水分,分别测量全心质量、左心室质量以及胫骨长度,以全心质量/体质量(mg/g)代表全心质量指数(heart mass index,HMI),以左心室质量/体质量比(mg/g)代表左心室质量指数(left ventricular mass index,LVMI),并计算心脏质量/胫骨长度(heart weight/tibial length,HW/TL)比值。

1.5 心肌纤维化程度检测

小鼠心脏经4%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片,按常规染色步骤进行Masson染色并拍照,用Image J软件分析各组心脏的纤维化程度。

1.6 活性氧簇(ROS)生成量测定

小鼠心脏在固定液(含4%的多聚甲醛、5%的蔗糖和20 mmol/L的EDTA,pH=7.4)中固定10 min后,经液氮速冻行冰冻切片。按照荧光染料二氢乙啶(DHE)试剂盒说明检测心肌组织冰冻切片中ROS的生成量,避光用荧光显微镜拍照并用Image J软件分析结果。

1.7 超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量测定

按照试剂盒说明书测定心肌组织中氧化应激标记物SOD和MDA的含量,并用分光光度计检测各组结果。

1.8 RT-PCR法检测心肌组织相关基因表达

用Trizol试剂从小鼠心脏组织中提取出总RNA,并采用紫外吸收测定法分析RNA的浓度和纯度。按照试剂盒操作说明对RNA进行逆转录以合成cDNA,通过RT-PCR技术检测相关基因的表达水平,反应条件为:95 ℃预热5 min;95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,共40个循环,各基因反应条件均一致。基因登录号:GAPDH:14433;ANP:230899;β-MHC:140781;Collagen-1:12842。引物GAPDH、ANP、β-MHC和Collagen-1购自上海吉凯基因公司。引物设计见表1。

表1 相关基因序列Table 1 Related gene sequence

1.9 Western blot法检测心肌组织相关蛋白表达

常规提取各组心肌组织蛋白,并用蛋白质定量法测定其蛋白含量。各泳道按40 μg蛋白含量进行上样,经聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离,湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,用5%的脱脂牛奶室温封闭2 h,将切好的各条带分别放入ANP(1 ∶1 000)、β-MHC(1 ∶1 000)、Collagen-1(1 ∶1 000)、Nrf2(1 ∶1 000)、Nox4(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶4 000)的抗体管中,4 ℃过夜孵育。TBST缓冲液摇洗条带3次,再分别加入对应的辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)标记的二抗(1 ∶5 000)管中,室温下继续孵育2 h,TBST摇洗条带3次,通过Bio-Rad照相系统成像并分析结果,以GAPDH作为内参照,检测各蛋白的表达情况。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠心脏功能比较

小鼠心脏超声检测结果显示:与对照组相比,ISO组小鼠的心脏收缩功能显著下降,表现为LVEF和LVFS值明显降低(P<0.01),而给予药物处理后,可显著提高BBM+ISO组小鼠的心脏收缩功能(P<0.01);与对照组相比,BBM组小鼠的LVEF与LVFS值未见明显变化(P>0.05,见表2)。

表2 各组小鼠心脏超声检测结果Table 2 The ultrasonic parameter of mice in each

2.2 心肌肥厚组织学指标比较

小鼠各标本的组织学指标显示,与对照组相比,ISO组小鼠的LVMI、HMI和HW/TL显著升高(P<0.01),而给予药物处理后,可显著降低BBM+ISO组小鼠的LVMI、HMI和HW/TL值(P<0.05或0.01);与对照组相比,BBM组小鼠的LVMI、HMI和HW/TL值没有显著差异(P>0.05,见图1)。

2.3 心肌纤维化程度比较

心脏切片Masson染色结果显示,与对照组相比,ISO组小鼠的心肌纤维化程度显著升高(P<0.01),而给予药物处理后,可显著降低小鼠心肌纤维化进展(P<0.01);与对照组相比,BBM组小鼠的心肌纤维化程度没有显著改变(P>0.05)。此外,与对照组相比,ISO组小鼠Collagen-1的基因与蛋白表达水平均明显上调(P<0.01),而BBM+ISO组小鼠Collagen-1基因的转录及翻译下调(P<0.01);同样,与对照组相比,BBM组小鼠心肌Collagen-1的基因与蛋白表达无显著差异(P>0.05,见图2)。

与对照组相比,##P<0.01;与ISO组相比,*P<0.05,**P<0.01

与对照组相比,##P<0.01;与ISO组相比,*P<0.05,**P<0.01

2.4 心肌肥厚相关标志物的基因及蛋白表达变化

RT-PCR和蛋白检测结果显示,与对照组比较,ISO组小鼠心肌组织中心肌肥厚相关标志物β-MHC和ANP的基因与蛋白表达水平均明显上调(P<0.01),而给予药物处理后,可显著下调BBM+ISO组小鼠心肌肥厚相关标志物β-MHC和ANP基因的转录及翻译(P<0.01);与对照组相比,BBM组小鼠心肌肥厚相关标志物的基因与蛋白表达均无显著差异(P>0.05,见图3)。

2.5 心肌组织氧化应激水平比较

氧化应激水平相关检测结果显示,与对照组相比,ISO组小鼠心肌组织中SOD含量显著降低,MDA含量显著升高,ROS生成量明显上升,并且氧化应激标志蛋白Nox4表达显著上升,抗氧化蛋白Nrf2表达显著下降(P<0.01),而给予药物处理后,可显著改善BBM+ISO组的上述指标,降低小鼠心肌组织的氧化应激水平(P<0.01);与对照组相比,BBM组小鼠上述心肌氧化应激指标均无显著差异(P>0.05,见图4)。

与对照组相比,##P<0.01;与ISO组相比,*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

目前,肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂和钙通道阻滞剂仍是治疗心肌肥厚的临床常用药物[8,9]。然而,这些外源性生物合成药物会产生明显副作用,如出现干咳、血管性水肿、低血压、头晕、头痛等不适症状[2]。因此,寻找新的、可替代的治疗方法并进一步阐明其内在机制具有重要意义。近年来,随着人们对具有心血管保护效应的中药材的探索越来越感兴趣,一种从伏牛花植物中提取的小分子化合物小檗胺也受到越来越广泛的关注。本研究观察到,给予小檗胺药物处理后可以显著改善心肌肥厚的小鼠心脏功能的恶化,这为小檗胺抗心肌肥厚提供了实验可能,有望成为一种新的抗心肌肥厚的临床药物。

心脏质量增加是压力超负荷引起的心肌肥厚的一个重要标志,因此,HMI、LVMI和HW/TL值可间接反映机体的心肌肥厚程度[10]。本研究观察到,相较于正常组小鼠,皮下注射ISO建立的模型组小鼠LVMI、HMI和HW/TL值显著升高,而给予小檗胺药物处理后,可以显著降低心肌肥厚小鼠的LVMI、HMI和HW/TL值。另一方面,左心室压力负荷持续增加在分子水平上又可以导致心肌肌球蛋白胚胎型β-MHC基因的激活和再表达,同时也会刺激心房合成、贮存和分泌大量的ANP[11,12]。本研究同样观察到,ISO组小鼠心肌肥厚相关标志物β-MHC和ANP的表达明显上调,给予药物处理后,可显著抑制β-MHC和ANP的基因转录和翻译,上述结果表明小檗胺预防性给药后能有效能减缓ISO所致的心肌肥厚进程。

心肌纤维化作为心肌重塑的主要病理基础,是心肌肥厚的主要病理改变,同时也是心室重构过程中发生心衰、恶性心律失常和猝死等致命事件的一个重要因素[13,14]。通过构建的模型组小鼠观察到,其心肌间质纤维化程度显著升高,而给予小檗胺药物处理后,可显著降低BBM+ISO组小鼠的心肌纤维化进展。此外,作为细胞外基质的主要成分,Ⅰ型胶原蛋白在心肌间质纤维化的发生发展中扮演着重要角色,其含量的增加可破坏正常的心肌纤维网络结构,从而阻碍了心肌细胞的有效伸缩,严重影响了心肌顺应性和射血能力[15]。在本研究中我们观察到,ISO组小鼠心肌组织Collagen-1的表达水平明显上调,同样药物处理可显著下调BBM+ISO组小鼠Collagen-1的基因转录和翻译,上述结果表明小檗胺预防性给药能有效能减缓ISO所致的心肌组织纤维化进程。

与对照组相比,##P<0.01;与ISO组相比,*P<0.05,**P<0.01

近年来研究证实,氧化应激损伤与心肌肥厚的发病机制密切相关,并且在心肌肥厚向心力衰竭的过渡中起着至关重要的作用[16,17]。当机体活性氧自由基的产生和抗氧化防御系统的能力失衡时,氧化应激损伤就会发生[18]。其中各种途径造成的ROS的升高可以促进心肌间质纤维化、抑制心肌收缩性和加速心肌细胞凋亡等多种不良后果。同时体内SOD、谷胱甘肽(glutathione,GSH)等抗氧化物质清除氧自由基能力减弱,导致脂质过氧化反应的终产物MDA的大量堆积,这些病理改变共同参与了心肌肥厚的持续恶化过程[19-21]。在本研究中观察到,心肌肥厚小鼠的心肌组织中SOD含量显著降低,MDA含量显著升高,ROS生成量明显上升,并且氧化应激标志蛋白Nox4表达显著上调,抗氧化蛋白Nrf2表达显著下降,而给予小檗胺药物处理后,可显著抑制BBM+ISO组小鼠心肌组织ROS的产生并降低其氧化应激水平,提示小檗胺能通过增强机体的抗氧化能力,抑制氧自由基的生成,来减轻ISO诱导的心肌肥厚小鼠的氧化应激损伤。

综上所述,本研究首次观察到小檗胺具有显著的抗小鼠心肌肥厚的效应,能够有效改善小鼠心脏功能恶化并抑制心肌肥厚的发展,其作用可能与减轻心肌氧化应激损伤,抑制心肌组织纤维化的进展密切相关。然而,小檗胺发挥上述保护作用的潜在信号通路尚未完全阐明,因此,针对小檗胺的心血管保护效应还需进行更深入的机制探究,从而为心肌肥厚的防治提供更完善的策略。