界面物理化学特性在动物营养消化研究中的应用与展望

汤少勋，党坦，谭支良

（1. 中国科学院亚热带农业生态研究所，亚热带农业生态过程重点实验室，畜禽养殖污染控制与资源化技术国家工程实验室，农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站，湖南省畜禽健康养殖工程技术中心，湖南 长沙 410125；2. 中南大学冶金与环境学院，湖南 长沙 410083）

瘤胃微生物对纤维物质的高效降解是反刍动物高效利用粗饲料资源的根本原因，并因其能缓解人畜争粮矛盾而倍受关注。饲料纤维或营养物质的消化利用是一个非常复杂的过程，涉及到物理、化学、生物学等过程。在传统动物营养学研究中，对饲料纤维物质的降解或营养物质消化利用的研究主要集中在对饲料化学组成、肠道微生物种类与组成、营养物质与宿主间的关系等，在解析饲料营养物质消化与利用的复杂过程与机制方面，还面临着系列难点与考验，急需新的理论与技术对现有理论进行丰富和完善。界面物理化学是研究物质在多相体系中其表面特征，以及发生在其表面的物理与化学过程及其规律的科学，其研究方法目前广泛应用于材料学、环境学、土壤学、高分子化学、日用化工、精细化工、生命科学和药学等领域。而消化道微生物或消化液对营养物质的降解和消化同样是建立在微生物或消化液与营养物质间界面基础上进行的。如瘤胃细菌对纤维物质降解利用的首要条件是与纤维物质发生作用[1]，在紧密黏附于纤维物质表面的基础上对其进行降解利用[2-3]。瘤胃细菌通过向纤维底物运移，进而在底物表面分别发生非特异性与特异性黏附，并进行增殖，且每一过程都以前一过程的顺利完成为基础[4]。并认为细菌对底物的粘附作用受其表面物理化学特性的影响[5-6]。

另一方面，微生物及酶对营养物质的利用基本都是在液体环境条件下进行的，这样在饲料营养物质消化及利用过程中就存在微生物与饲料营养物质间的固－固界面，以及营养物质与消化酶或微生物与其生存媒介间的固－液界面。发生在这些界面之间的物理化学特性的变化与营养物质的消化或降解间可能存在一定的关系。有研究认为细菌表面活性与质子离解或结合引起的环境条件（pH，离子强度及疏水性）的改变密切相关[7]。发现细菌在低离子强度溶液中接近底物表面时存在细菌无法克服的能量屏障[8-9]，在中等离子强度的溶液中，细菌与底物表面的距离仅几十毫微米，细菌对底物的捕获是可逆的。而在高离子强度下，静电的作用受到强烈抑制，细菌与底物的互作在不同距离下都表现出净吸引的现象，并导致不可逆的吸附[10]。O’Sullivan等[11]对纤维降解菌中厚壁菌门的三种梭菌降解纤维过程中群落富集特征的研究结果表明，纤维降解速率主要受细菌表面膜结构，以及底物可供细菌定植的表面积的影响。这些研究结果表明，营养物质降解过程中微生物及底物的界面物理化学特性的变化与营养消化密切相关。因此，解析饲料底物界面特性、微生物自身界面特性，以及微生物生存媒介界面特性变化与饲料营养消化降解间的关系，对深入理解饲料营养的消化利用机制具有重要意义。本文从饲料底物界面特性、微生物自身界面特性，以及微生物生存媒介界面特性变化与饲料营养消化降解间的关系进行综述，以期为丰富动物营养学理论提供参考。

1 营养底物界面特性在营养消化过程中的作用

1.1 饲料比表面积

肠道微生物对饲料营养的分解利用不仅与其化学组成有关[12-13]，而且与饲料表面的物理化学特性有关[14]。有研究表明，肠道微生物降解饲料的首要条件是与饲料颗粒表面可降解位点进行结合，在饲料物理性质中，饲料颗粒比表面积（special surface areas，SSA）与饲料颗粒大小，以及饲料可降解位点的数量密切相关，饲料颗粒的比表面积越大，意味着可供微生物吸附的可降解位点数也越多，进而饲料越易被降解。因此，在饲料界面的理化性质中，其颗粒的比表面积是影响瘤胃细菌纤维降解效率的一个重要因素[15]。

饲料颗粒的比表面积是反映饲料颗粒物理特性的一个重要指标，它是指单位质量物质的总表面积，即每克物质总表面积。底物比表面积越大，其表面效应（如表面吸附能力、可吸附位点等）越强。有研究发现，瘤胃纤维物质的消化主要受纤维细胞壁上可供纤维素酶作用位点数的限制，而不是受纤维降解菌的浓度的限制[15]。由此可见，当瘤胃中降解细胞壁的微生物达到一定数量时，饲料的消化过程就主要受饲料颗粒表面可供微生物定植和侵袭面积的限制。高巍[16]研究发现，提高植物饲料颗粒表面积可显著增加纤维降解菌在饲料颗粒表面附着的数量以及木聚糖酶的活性。Maaroufi等[17]研究发现，在体外发酵中，粉碎豌豆累积产气量、pH值、氨态氮和可溶性碳水化合物浓度的变化与豌豆颗粒比表面积存在显著相关性。提高粉碎细度会提高累积产气量，但降低pH值和可溶性糖浓度。刘勇等[18]研究了不同比表面积稻草秸秆体外发酵特性，发现提高发酵底物（稻草中性洗涤纤维）的比表面积可有效提高稻草纤维物质的消失率和氨氮浓度。Weimer等[19]研究报道称，纤维素降解速率与纤维素总比表面积呈强烈正相关（R2=0.978）。Miron等[4]认为粗饲料颗粒越小，其比表面积就越大，粗饲料颗粒表面供纤维分解菌及酶作用的有效面积也越大，进而更有利于纤维物质的降解。

对不种类饲料颗粒比表面积的研究发现，在相同粉碎粒度下，不同粗饲料原料样品的比表面积存在显著差异，农作物秸秆中以水稻秸秆的比表面积最高，然后依次为小麦秸秆和玉米秸秆。来自这些秸秆的中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）以及酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）的比表面积按水稻秸秆＞小麦秸秆＞玉米秸秆的顺序依次减小。而且秸秆饲料比表面积随粉碎细度的增加而增加[20]。研究结果说明，引起不同品种饲料营养消化特性差异的原因可能不仅与化学成分密切有关，而且与其比表面积有关。因此在饲料消化评价过程中，饲料颗粒的比表面积也是一个不可忽视的因素，但其对饲料消化的贡献率有待更多的研究加以明确。

表1 不同来源和颗粒大小粗饲料原料及纤维比表面积（m2/g）（引自：党坦等[20]）Table 1 Specific surface area (m2/g) of original and fiber samples of forage at three levels of particle size

1.2 阳离子交换量

在饲料纤维多聚物表面含有许多羧基、氨基、去脂肪羟基和酚类羟基等功能性基团，所有这些基团都具有与金属离子相结合的能力。在一定的pH条件下，单位细胞壁纤维多聚物与某种金属离子相结合的能力就称为饲料纤维的阳离子交换量（cation exchange capacity, CEC）。彭艺等[21]对我国反刍动物常用三类饲料的CEC值的测定发现，不同类型饲料的阳离子交换量的变化范围较大，而同一种类饲料不同品种间阳离子交换量变化较小。其对28种饲料的CEC值与化学成分的进一步研究发现，饲料的阳离子交换量与其粗蛋白及木质素含量存在极显著的正相关关系，而与其NDF、ADF 和纤维素含量存在显著负相关关系，与其它化学成分的相关性不明显或没有相关性。

有研究表明，饲料的阳离子交换量能影响反刍动物瘤胃缓冲性能、微生物对纤维的发酵和消化、以及机体内微量元素的平衡等[22-23]。Salimei等[24]研究发现，体外发酵48 h后粗饲料干物质降解率与粗饲料CEC值存在负相关关系，粗饲料NDF的CEC值与半纤维素消化率相关性不显著。而粗饲料发酵延滞时间则与粗饲料CEC值存在正相关性。彭艺等[25-26]研究发现，不同CEC值日粮在绵羊十二指肠与直肠的流通量和消化率存在显著差异，各种营养物质的流通量随着日粮CEC值的升高呈逐渐下降的趋势，而营养物质的消化率却呈逐渐上升的趋势。因此，在评价饲料营养价值中，可以把饲料阳离子交换量作为一个理化指标来评价饲料纤维的消化特性。

2 消化液界面特性在营养消化过程中的作用

2.1 表面张力

表面张力是指液体表面任意二相邻部分之间垂直于它们单位长度分界线相互作用的拉力。工业微生物领域的研究发现液体表面张力与微生物在固体表面的粘附能力间存在相关性[27]。瘤胃微生物在降解饲料过程中一般都存在于液体环境，瘤胃液表面张力的改变是否也会影响饲料的降解或微生物的功能？

很多研究文献报道证实，在日粮中添加非离子表面活性剂可促进厌氧真菌和细菌的生长、刺激纤维素降解酶的释放、增强酶活性、促进底物与酶的附着[28-30]。这可能与非离子表面活性剂能改变消化液的表面张力有关。刘勇等[18,31]在纤维物质的体外发酵研究中发现，发酵液表面张力的变化对纤维物质的体外发酵特性有直接影响。当发酵液表面张力降低至36 mN/m时，极显著降低中性洗涤纤维的消失率，并影响瘤胃微生物膜通透性及微生物表面疏水性。党坦[32]研究发现，瘤胃液表面张力与秸秆干物质消化率间存在显著的正相关关系。笔者对不同表面活性剂在相同表面张力条件下的体外发酵研究结果表明，相对表面活性剂的种类，表面张力对粗饲料发酵模式（表2）以及微生物膜通透性和干物质消失率（表3）的影响更为明显。

表2 非离子表面活性剂及表面张力对粗饲料体外发酵发性脂肪酸产量与组成（%）的影响Table 2 Effects of alkyl polyglucoside and surface tension on volatile fatty acid production (mol/L) and molar ratio (%) for forage fermented in vitro.

表3 非离子表面活性剂及表面张力对粗饲料体外发酵特性与细胞膜通透性的影响Table 3 Effects of alkyl polyglycoside and surface tension on in vitro fermentation charateristics and membrane permeability of rumen microbe

微生物在代谢过程中产生的代谢产物具有良好的表面活性特性，可有效降低液体表面张力[33]。根据Traube规则，同一种溶质在低浓度时表面张力的降低效应与浓度成正比，并且在低浓度时增加浓度对表面张力的影响比高浓度时显著[34]。瘤胃微生物在其生长代谢过程中产生的某些代谢产物表现出一定的表面活性（如降低界面张力、渗透、润湿、乳化、分散等）。张秋卓[35]研究发现，稻草秸秆在生物降解过程中添加生物表面活性剂时对秸秆的降解可以起到增效作用。消化液表面张力在多大程度上影响饲料的消化与降解，以及微生物的功能，还需要更多研究加以明确。另一方面，消化道微生物代谢过程中产生的生物活性剂在饲料消化过程中产生多大的贡献也需要更多研究加以诠释。

2.2 氧化还原电位

氧化还原电位（oxidation reduction potential, ORP）是用来反映溶液中所有物质表现出来的宏观氧化—还原性。电位为正表示溶液显示出一定的氧化性，氧化还原电位越高，氧化性越强，为负则说明溶液显示出还原性，电位越低，则还原性越强。瘤胃内ORP是反映瘤胃内环境的重要指标，其动态变化与微生物的数量和代谢强度，以及pH值密切相关。Baldwin和Emery[36]研究认为，瘤胃中与细菌细胞有关的还原物质的比例相当低，发现瘤胃ORP与瘤胃pH值存在一定的等量关系，并认为瘤胃液的还原性特性也可如pH值一样作为衡量发酵效率的指标。Barry等[37]研究发现，给绵羊饲喂两种日粮时瘤胃ORP没有显著差异，但一天之内ORP的变化显著，并在饲喂前主要表现出氧化性，而在饲喂后主要表现出还原性。覃春富[38]研究发现，玉米秸秆日粮组瘤胃液ORP值显著小于混合粗饲料组。而华金玲等[39]研究发现，日粮精粗比不影响山羊瘤胃液的ORP值。陈伟[40]的研究也发现不同粗饲料间瘤胃培养液的氧化还原电位存在显著差异，且发现瘤胃培养液的氧化还原电位与乳酸和乙丙比间存在显著正相关关系，而与pH值、乙酸、丙酸、总挥性脂肪酸及氨态氮存在显著的负相关关系。而薛丰[41]研究发现，瘤胃液ORP随粗饲料品质的提高具有下降的趋势，但不同粗饲料间没有显著差异。蔡丽媛[42]对热应激条件下山羊瘤胃发酵的研究表明，热应激条件下山羊瘤胃ORP显著上升，从非热应激条件下的-253.1 mV上升到热应激下的-153.3 mV，同时瘤胃内纤维素酶活性及总VFA产量显著下降。姜岷等[43]研究发现，在产琥珀酸放线杆菌厌氧发酵过程中添加氧化还原调控剂可提高细菌产丁二酸的速率及培养液中的菌体浓度。以上研究表明，瘤胃内氧化还原状态与饲料营养和发酵模式、微生物的代谢以及瘤胃内环境的平衡存在密切关系，在评估饲料营养、微生物活性及瘤胃功能时，氧化还原电位可在一定程度上作为评价指标体系的一个指标。

3 微生物界面特性在营养消化过程中的作用

3.1 微生物表面疏水性

细菌表面结构组成特异性使其具有疏水性的物理特性，细菌在各种生物和非生物表面/界面的非特异性粘附，以及其对聚合物的降解受其表面疏水性（cell surface Hydrophobicity, CSH）的影响[5-6]。细菌表面疏水性与其表面组成特性（如菌毛、多肽等）及细菌种类密切相关，并受细菌的生长媒介条件（如媒介温度与pH值）、细菌的生长期与表面结构，以及生物表面活性剂等因素的影响[44-45]。有研究认为，微生物表面疏水性是影响微生物吸附与相互凝集的重要因素[46]，疏水性细菌易吸附于疏水性基质表面，而亲水性细菌则易吸附于亲水性基质表面。医学及工业领域的研究发现，细菌在物质表面（如口腔表面、矿物颗粒、上皮细胞和生物材料等）的吸附排列及流动性在很大程度上受其表面疏水性的影响[47]。刘勇[31]在动物营养领域的研究结果显示，瘤胃细菌表面疏水性在发酵早中期受发酵底物表面特性的影响。Liu等[48]应用Expected Measurement Moving Average–Machine Learning (EMMA-ML) 模型，进一步分析了混合瘤胃微生物表面疏水性与纤维发酵指标间的线性关系，发现微生物细胞膜表面疏水性真实值高度依赖于纤维的消化率、氨氮浓度及微生物初期表面疏水性。党坦[32]在不同粗饲料体外发酵研究中发现，瘤胃微生物表面疏水性不受粗饲料种类的影响，但受粗饲料种类与饲料颗粒大小互作的影响，即不同种类粗饲料随其颗粒大小的改变，微生物表面疏水性的变化规律不一致。有研究认为细菌表面疏水性是影响两相反应的重要因素之一，并与细菌对底物的黏附现象有关[49]。瘤胃中微生物组成非常复杂，其表面结构的差异也会引起其表面疏水性的不同。在饲料纤维降解与消化过程中，肠道微生物表面疏水性可作为一个理化指标来衡量其生物学功能。

3.2 微生物膜通透性

细菌细胞膜具有一定的流动性及通透性，适宜的流动性与通透性是保证细胞处于正常生理功能的重要条件，当细胞膜的流动性及通透性发生改变时，其生理功能也发生改变[51]。微生物在对底物吸附、生物膜形成，以及降解物质过程中涉及到微生物活性物质分泌、细胞膜的信号传导、基因表达、营养吸收与代谢产物的排出、水分与离子的交换等一系列生理功能，而这些生理功能在很大程度上受微生物细胞膜通透性的影响[52]。有研究认为，日粮中添加非离子表面活性剂能提高饲料的降解或消化率，是由于非离子表面活性剂本身所具有的疏水结构可作用于细菌细胞膜，增加细胞膜的流动性及通透性，从而使胞内酶更容易流向胞外，进而提高消化能力[28]。党坦等[32,50]的研究表明，不同种类粗饲料发酵48 h后瘤胃微生物细胞膜通透性存在显著差异，还发现瘤胃微生物细胞膜通透性与干物质消化率存在显著的二次曲线关系。其对不同种类粗饲料纤维发酵的研究结果表明，微生物细胞膜通透性与微生物蛋白产量及干物质消化率间存在显著正相关关系，而与氨态氮的浓度间存在显著负相关关系。这些研究结果表明消化道微生物细胞膜通透性与饲料的消化之间存在密切关系，微生物表面物理特性是衡量微生物生理功能的重要指标。Liu等[53]根据纤维体外发酵指标（不同时间点发酵液pH值，氨态氨浓度、中性洗涤纤维消失率及产气量等），利用Box-Jenkins Operator和Covariance Perturbation Theory Operators理论，进一步构建了利用这些指标对瘤胃微生物细胞膜通透性的预测模型，对77 781个观察值的分析表明，预测模型的敏感性、特异性及精确性都高于0.89，马修斯相关系数大于0.78。以上研究结果表明，微生物膜通透性作为微生物细胞重要生理特性之一，在饲料营养消化利用过程中扮演重要的生物学功能，在研究饲料营养的消化利用机制过程中应给予必要的考虑。

表4 不同饲料干物质消失率、氨态氮含量及瘤胃微生物界面物理化学指标（引自：党坦等[50]）Table 4 Dry matter disappearance, ammonia nitrogen content and interface physical and chemical characteristics of ruminal microbe of different forage

3.3 表面电动电位

细菌细胞表面电动电位或zeta电位（electrokinetic potential，ζ）是表征细菌细胞表面物理特性的指标之一，它与细菌的吸附和生物膜的形成有关，并在维持细胞膜的稳定性上具有重要作用[54]，且能影响细菌的吸附[55]等。细菌细胞表面电动电位的绝对值越高，形成的微生物体系越稳定；反之，微生物聚集程度就越严重，体系也更不稳定。研究发现死亡细菌表面电动电位绝对值更低[56]；Soni等[57]在不同营养基中培养E.coli，Salmonella Newport，Pseudomonas sp.等单菌，认为细菌在饮水中其表面电动电位表现出的种类差异与其生理状态相关。有研究发现，细菌表面电动电位与溶液中离子浓度和pH值高度相关[44]。肠道微生物表面也具有相似的zeta电位特性，刘勇[31]和党坦[32]在体外模拟瘤胃发酵培养中测得微生物表面zeta电位值在-24 mV至-40 mV之间，其进一步研究发现，瘤胃微生物表面电动电位不受秸秆颗粒比表面积的影响，但不同种类秸秆发酵后瘤胃微生物表面zeta电位存在显著差异（表4）。目前应用表面zeta电位表征肠道微生物表面物理化学特性，以及肠道微生物表面zeta电位与营养消化利用间关系的研究还比较少，还需要更多研究明确其在动物营养学中的作用，以及其对微生物本身活性特征的影响等。

4 展望

1）进一步明确不同界面物理化学特性指标在动物营养中的生物学意义：在动物营养研究中，营养物质的消化利用，以及微生物的功能作用都有其明确的生物学意义，目前界面物理化学特性指标在动物营养学中的应用还刚刚起步，对其在营养学或生理学中的意义，或其作用与贡献并不是十分明确，在今后的工作中应明晰界面物理化学特性指标与营养消化吸收及微生物功能与组成等的关系和作用，为从全新的角度解析营养消化利用的机制提供科学依据。

2）优化界面物理化学评价指标分析测定方法：目前界面物理化学评价指标的分析测定都是借鉴于其他学科的技术方法，生命科学或者说动物营养学领域有其自身的特点，这些指标的测定分析方法可能不完全适用于动物营养科学领域，在今后的研究中应对现有的方法进行进一步的改进和优化。

3）界面物理化学评价指标的丰富：饲料营养的消化与吸收过程首先是发生在饲料、微生物或肠道的表面，除文中提到的界面物理化学特性指标外，可能还存在其他界面物理化学特性指标，今后应加强与饲料消化、吸收及微生物功能密切相关的界面物理化学特性评价指标的发掘，为从更全面的角度解析营养的消化吸收机制提供更丰富的评价指标。