仔猪肠道发育和氨基酸营养调控机制

谭碧娥，王婧，印遇龙

（中国科学院亚热带农业生态研究所，亚热带农业生态过程重点实验室，湖南 长沙 410125）

肠道生长是仔猪生长发育的核心和快速生长的基础。肠道是消化和吸收营养物质的主要场所，也是抵抗病原体的重要屏障。由于仔猪的肠道发育不够健全，早期断奶极易引起仔猪肠道黏膜屏障损伤及消化功能紊乱，继而导致自由采食量下降，能量摄入不足，腹泻，甚至死亡。通过优化仔猪日粮营养水平促进肠道发育，改善肠道黏膜损伤，是缓解仔猪早期断奶应激的有效途径[1]。氨基酸是小肠优先利用的重要营养物质，参与了细胞生长过程中各种重要的生理生化过程[2]，小肠黏膜氨基酸的利用对肠道发育和维持肠道健康具有重要作用。

1 仔猪肠道形态结构发育和断奶适应性变化规律

仔猪肠道的发育过程主要分三个阶段：1）胚胎期，肠道的初步形成与生长；2）哺乳期，肠道的快速发育；3）断奶期，肠道的损伤与修复。

1.1 胚胎期肠道形成与生长

肠道的器官发生始于早期胚胎发育阶段，由内胚层细胞迁移形成间质细胞环绕的简单肠管，且肠管壁层存在增殖细胞[3]。随后，由未分化细胞形成的层状内胚层，经前端至尾端转变为具有简单柱状上皮细胞的新生绒毛，绒毛细胞继而分化为具有微绒毛结构、刷状缘水解酶以及营养转运载体的肠道上皮细胞。增殖细胞在初生绒毛之间的区域聚集，并侵入基底间质区形成原始隐窝[4]。隐窝中含有多能干细胞，在隐窝底部增殖，并沿着隐窝—绒毛轴迁移至绒毛顶端，在此过程中分化为吸收型上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞和内分泌细胞[5]。此外，肠道上皮还存在M细胞和塔夫细胞[6]。绒毛由分化的肠上皮细胞排列形成后，胎儿开始吞咽并消化羊水，胎儿从羊水中吸取自身所需的10%～14%的营养和能量用于自身组织合成及发育[7]。除了营养物质，羊水中还包含了具有生物活性的非营养性物质，如生长因子和激素，对调节胎儿肠道发育至关重要。

1.2 哺乳仔猪肠道的发育

新生仔猪为了适应由宫内生长环境到独立的宫外生长环境的转变，肠道结构和功能发生了巨大的改变。仔猪出生后，初乳刺激肠道快速生长，主要表现为肠道DNA合成和蛋白含量增加，细胞周转速率下降，并伴随着绒毛及微绒毛表面积的扩张。出生后24 h小肠相对体重之比是出生时的2倍[8]，肠道隐窝深度与绒毛高度分别增加了40%和30%[9]，肠道消化面积增加了50%[10]。在初生的2～3天中，肠道上皮细胞摄取初乳中的蛋白质（免疫球蛋白、激素、生长因子等）并储存在消化液泡中，使细胞体积急剧增大。随着肠道逐渐成熟，消化液泡由近端空肠至远端回肠慢慢消失，这一过程大约持续2～3周[11]。肠道通过折叠增加自身表面积，肠黏膜折叠形成纵向的环形皱襞，每个皱襞中包含多个隐窝—绒毛单位。仔猪出生后1周，肠黏膜血流量增加，绒毛长度也随之提高，且绒毛表面逐渐出现大量的横向沟纹，但随着仔猪日龄的增加，绒毛变短变粗，绒毛横向沟纹的数量与深度减少[11]。Wang等[12]发现，仔猪空肠微绒毛在1日龄时长、细且稀疏，随着日龄的增长绒毛逐渐变为短、粗且密集，同时肠道杯状细胞数逐渐增加（图1）。仔猪14日龄时，绒毛由初生时的指状变为舌状，隐窝深度进一步加深，绒毛表面与7日龄相比变得光滑[13]。

1.3 断奶仔猪肠道的损伤修复

图1 不同日龄哺乳仔猪（1、7、14、21日龄）和14日龄早期断奶仔猪（断奶后第1、3、5、7天）空肠微绒毛结构（扫描电镜，放大倍数× 200）（引自：Wang等[12]）Fig. 1 The structure of jejunal microvillus in 1, 7, 14, 21-d-old suckling piglets and piglets on days 1, 3, 5, 7 post-weaning at 14 d of age (scanning electron microscopy, magnification × 200) (Quoted from Wang et al. [12])

在断奶阶段，仔猪肠道面临着许多应激因子，影响着肠道形态结构和生长发育[9]。断奶应激造成肠黏膜结构和功能损伤，诱导肠道紊乱和腹泻[14-15]。在断奶后的前2天，肠黏膜相对重量（相对于体重）可下降20%～30%[16]，肠黏膜屏障损伤最严重发生在断奶后的第3～5天[14,17]。肠黏膜屏障受损主要表现为肠道绒毛萎缩，仔猪21日龄断奶后24 h内，绒毛高度降低了75%，绒毛高度与隐窝深度比也随之降低。14日龄断奶仔猪空肠和回肠绒毛的高度和密度在断奶第3 天明显降低，随后在第7天逐渐恢复（图1）。同时，14日龄早期断奶导致了断奶后第3天和第5天空肠中E-cadherin和occludin的基因表达量以及occludin和ZO-1的蛋白水平显著降低，肠道屏障功能受损[12]。伴随着绒毛高度的降低和隐窝深度的增加，肠道刷状缘酶活也在断奶后的第4～5天降至最低值[18]。

肠道黏膜具有损伤后快速修复的能力[19]。肠黏膜屏障在断奶后第5～10天才恢复至正常水平[16]。Hu等[14]发现，绒毛高度和隐窝深度在断奶后的第14天可恢复至断奶前水平。仔猪肠道损伤后的修复是一个十分复杂的过程，包括了肠上皮细胞的重建、细胞增殖、凋亡、血管再生与黏膜重塑[20]。小肠绒毛的萎缩主要是由于肠道细胞增殖速度缓慢，以及大量成熟肠细胞在绒毛顶端脱落。肠道绒毛高度的降低导致了肠道上皮细胞从隐窝底部至绒毛顶端迁移距离 （EMD）缩短，EMD在断奶第5天时显著降低。EMD的缩短使肠上皮细胞迁移速度加快，与断奶第0天比，肠上皮细胞迁移速度在断奶后第2、4、8天时分别加快了1.86、3.42和2.60倍[21]。肠黏膜损伤的快速重建，主要依靠已分化的肠上皮细胞而非隐窝区域未分化的细胞[22]。钾离子通道的激活与多种细胞的生长或分化有关[23]。断奶后钾离子通道表达量的增加，在损伤后分化的肠上皮细胞的迁移过程中具有重要作用[12,22]。细胞内多胺与肠黏膜的生长和修复进程密切相关[24]。仔猪断奶后的第1～3天空肠和回肠中亚精胺和精胺浓度增加，肠道多胺合成过程中的第一限速酶ODC基因和蛋白表达在断奶第3天显著升高[12]，可以作为肠道损伤修复的指征。

2 仔猪肠道黏膜上皮细胞氨基酸的代谢利用

2.1 肠道氨基酸代谢

日粮蛋白质在被运输到肠细胞之前在消化道中被水解成小肽和游离AA[25]。日粮中20%～97%的AA被小肠首过代谢，只有低于20%的AA用于肠黏膜蛋白质合成[3]。进入肠道中的几乎所有谷氨酸和天冬氨酸，67%～70%的谷氨酰胺，30%～40%的脯氨酸和35%的支链链(BCAA)被猪小肠分解[26-27]。许多研究结果表明，氨基酸而非血糖是小肠黏膜的主要能量来源[2]。Reeds等[28]采用外科手术和同位素技术研究发现，尽管小肠黏膜细胞摄取了大量的葡萄糖，但大多用于糖原的合成，仅5%被黏膜利用。日粮谷氨酰胺及与谷氨酰胺代谢有关的天冬氨酸、谷氨酸不仅为小肠黏膜提供能量，也是细胞的蛋白质、核酸及氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）等物质合成的前体和促进剂，对维持黏膜的正常形态、结构和功能具有重要作用[28]。体外培养的猪肠上皮细胞利用谷氨酰胺的基础代谢和ATP生成均高于葡萄糖，验证了肠上皮细胞优先利用谷氨酰胺作为能量来源的结论[29]。Yao等[30]发现，α-酮戊二酸（AKG）对肠道功能性氨基酸代谢具有节约效应。作为连接细胞内碳氮代谢的关键节点，AKG可直接进入三羧酸循环为肠道提供能量并剂量依赖性地抑制肠上皮细胞对谷氨酰胺和谷氨酸的降解，降低丙氨酸、天冬氨酸、氨和二氧化碳等代谢产物的形成，使更多的谷氨酰胺和谷氨酸用于机体蛋白质的合成。肠道内的细菌也会吸收和降解游离AA和小肽，产生氨、CO2、多胺、核苷酸、蛋白质和其他氮源 (包括亚硝酸盐、硝酸盐和谷胱甘肽)。肠道细菌能降解所有的AA，主要涉及小肠中赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸和组氨酸的分解代谢[31-33]。

2.2 肠道氨基酸吸收和感应

仔猪出生后3 h内，单位质量肠黏膜中天冬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸和脯氨酸的吸收率显著下降；随后，脯氨酸吸收率显著增加，至7日龄达到最大值后逐渐降低，至28日龄脯氨酸吸收率趋于稳定水平。氨基酸转运速度的降低可能是由于肠黏膜单位面积内氨基酸转运载体的减少造成的，Yang[34]发现空肠中氨基酸转运载体B0AT1、ATB0和EAAC1的表达水平随着仔猪年龄增加而减少。但是天冬氨酸、蛋氨酸和赖氨酸的吸收率随着日龄的增长显著增加，至28日龄增加至最高值[35]。断奶应激降低了所有氨基酸的摄取率。仔猪出生后肠道的快速生长促进了肠道总氨基酸吸收能力的增加，断奶后出现的肠道绒毛萎缩和黏膜损伤会导致肠道氨基酸摄取率的短暂下降[35]。

肠道氨基酸的吸收由氨基酸转运载体介导。氨基酸转运载体可以调控氨基酸进入细胞内作用于相应的受体，或直接启动细胞信号，调控细胞内生理过程。Na+依赖性中性氨基酸转运载体SNAT2作为近年来发现的氨基酸转运感受体的典型代表，在调控氨基酸信号感应中发挥重要作用[36]。氨基酸饥饿、精氨酸、谷氨酸或亮氨酸能诱导肠上皮细胞SNAT2的表达，而谷氨酰胺抑制其表达；采用mTOR RT2Profiler PCR Array分析发现，SNAT2抑制后主要调控mTORC1上游调控因子；抑制SNAT2显著降低细胞增殖和蛋白合成[36]。PATs、CasR和T1R1/T1R3也是重要的氨基酸感应受体。PAT1不仅能够将胞外氨基酸直接转运入胞浆内，还能够作用于mTORC1[37]。PAT1能促进质子依赖性氨基酸的转运，促进肠腔蛋白质在肠道刷状膜缘酸性小环境的消化[38]。T1R1/T1R3作为直接感受机体能量状态和胞外氨基酸浓度的感受器，敲除后会直接影响氨基酸浓度作为信号传递到mTORC的过程[39]。此外，肠道微生物和宿主通过代谢感应也能调控氨基酸的利用。Ren等[40]发现，病原菌ETEC感染情况下，微生物发生了显著的变化，L.lactissubsp.lactis增加，进而通过产生γ氨基丁酸（GABA）激活肠道免疫信号；GABA转运载体2通过调控GABA从细胞外转至胞内而终止GABA信号（图2）。

图2 肠道微生物和宿主互作调控肠道免疫反应机制Fig. 2 The mechanisms of interactive regulation of intestinal microbe and host on immune responses

3 功能性氨基酸对仔猪肠道结构和功能的调控作用

氨基酸在肠道的代谢对营养和健康有重要意义[41]。本课题组大量研究证明，氨基酸尤其是功能性氨基酸在黏膜代谢和损伤修复中具有关键作用[29,42-47]。每天食入的谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和血液谷氨酰胺进入肠黏膜后，成为小肠能量的主要来源，为小肠养分的主动转运和蛋白质周转提供足量的ATP。在肠黏膜应激损伤修复过程中，精氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸等可作为线粒体能量基质被利用，促进肠上皮细胞DNA合成和损伤修复[48]。Xiao等[49]研究发现，N-乙酰-L-半胱氨酸能促进H2O2诱导损伤的肠上皮细胞的线粒体生物合成，改善细胞TCA循环，减少细胞凋亡和死亡（图3）。

精氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸是合成多胺的前体物，多胺与DNA、RNA以及蛋白质的生物代谢有关，在细胞分化、细胞周期的调节中起关键作用，对新生仔猪细胞增殖和分化至关重要，是小肠黏膜生长、发育、成熟、适应恢复所必需的物质[50]，可促进肠腺隐窝细胞的增殖、分化和移行，促进肠黏膜的损伤修复[22]。Wang等[51]研究发现，哺乳仔猪灌服腐胺和脯氨酸提高断奶后小肠黏膜多胺浓度和ODC蛋白表达，促进小肠黏膜细胞增殖和分化，从而促进黏膜成熟；脯氨酸显著提高空肠ZO-1、occludin和claudin-3以及回肠 ZO-1和claudin-1的蛋白表达，促进黏膜屏障功能。

图3 氨基酸促进肠道DNA合成和蛋白质合成的通路Fig. 3 The pathway of amino acids improving DNA and protein synthesis in the intestine

mTOR可调控氨基酸利用，从而作为肠道功能调控的靶标，调控作用包括蛋白质合成、免疫反应、线粒体功能、细胞增殖分化凋亡等[40,42,52-53]。精氨酸和Ala-Gln等通过激活mTOR信号通路促进肠上皮细胞质蛋白质合成（图3），同时抑制了泛素蛋白酶途径UBE3A基因表达而抑制蛋白质降解，从而促进损伤修复[42,53]。精氨酸和GABA等可激活mTOR通路，调控机体免疫功能[40]。精氨酸通过调控细胞因子和抗体产生提高肠道免疫功能[52]；通过抑制了TLR4活性和NFκB的磷酸化，从而抑制LPS诱导的TLR4-NFκB信号通路，缓解肠上皮细胞炎症损伤[42]。GABA能被Th17细胞通过GABA受体感应，从而激活mTOR信号通路，通过mTORS6K1-EGR2-GFI1通路影响肠道的Th17的活化以及IL-17的表达；抗生素处理情况下，补充高剂量GABA降低了ETEC感染下IL-7的表达[40]（图2）。

肠道氨基酸转运感受体作为氨基酸营养信号传导的重要环节，对肠道功能维持发挥重要作用。转运感受体感应胞外的刺激及激活胞内信号, 影响肠道上皮细胞的增殖分化与功能[54]，还与肠道防御机制相关。其中钙敏感受体CaSR在维持和恢复肠道稳态方面发挥着关键作用，激活CaSR可以刺激肠黏膜屏障再生[55]。芳香族氨基酸包括L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸作为CaSR的变构激动剂，通过激活CaSR信号通路缓解LPS诱导的仔猪肠道炎症反应[56]（图4）。在肠细胞中芳香族L-色氨酸能够通过激活CaSR信号通路募集β抑制蛋白2抑制NF-κB信号通路，阻断炎性信号转导，从而发挥抗炎的作用[57]。

图4 色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸（TPT）调控肠道炎症反应的机制Fig. 4 The mechanisms of tryptophan, phenylalanine and tyrosine (TPT) regulating intestinal inflammatory response

4 展望

肠道氨基酸的代谢对肠道发育和健康调控具有重要意义。肠道氨基酸的利用过程涉及胃肠道对蛋白质的消化、肠道及其微生物对蛋白质/氨基酸的代谢利用等环节，需要进一步深入研究神经内分泌对上述生理过程的调控。采用整合生理学方法研究肠道—肝脏—肌肉等多器官的协同代谢网络，以及神经内分泌对代谢网络的整合调控机制；将微生物与宿主作为一个整体开展研究，在肠道及其微生物互作影响蛋白质/氨基酸利用方面取得理论突破。此外，深入研究氨基酸感应信号途径，鉴定新的分子调节靶点，为肠道代谢紊乱等营养代谢失衡疾病的调控提供依据。靶向开发营养调控剂，研究其对仔猪肠道发育和健康的调控机制，为提高仔猪生产力提供新方法和技术。