水稻耐逆境种质创新研究十年回顾

肖国樱，邓力华，翁绿水，肖友伦，李锦江，于江辉，孟秋成

（中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室，湖南 长沙410125）

水稻是我国60%以上人口的主食。南方稻区是我国水稻的主产区，水稻种植面积及产量分别占全国的85%以上。其充足的温光资源不仅对水稻生长有利，也为水稻的病、虫、草害发生提供了有利条件。其地理和气候的多样性，也常常形成高温、低温、干旱、淹涝等逆境胁迫危害水稻生产。近年来，气候变化加剧，水稻耕作制度改变，水稻所遭受的逆境胁迫也日趋频繁和严重。培育耐多种逆境胁迫的水稻新种质显得更加迫切。

1 抗除草剂水稻新种质的创制

劳动力成本提高，倒逼水稻耕作制度改变，直播将是今后我国水稻栽培的主要方式[1]。草害是直播稻的主要减产因素。只要草害控制得当，直播稻与移栽稻产量相当、甚至更高。如果杂草控制不当，草害造成的产量损失少则10%，多则100%[2]。选择性除草剂恶草酮、氰氟草酯、二氯喹啉酸、苄嘧磺隆、吡嘧磺隆等能有效的控制稻田主要杂草，但控制杂草的效果还受施用时间、土地平整度、优势杂草种类、天气等多种因素影响。更重要的是这些选择性除草剂杀草谱较窄、残效期长、残留污染环境，影响后茬作物生长[3]。如咪草烟和咪唑乙烟酸是在美洲与一类称为Clearfield®rice的抗除草剂水稻配套使用、用于控制杂草稻的必备除草剂，它们在土壤中的残效期长达18周，不仅对后茬作物棉花、玉米、甜菜、油菜、花椰菜、生菜、土豆等造成伤害，而且还污染地表水，导致美国稻区地表水中残留量达到 1 μg/L，巴西稻区更是高达7 μg/L[4]。相比较而言，草铵膦和草甘膦是低残留的灭生性除草剂，在土壤中的半衰期为2-7 d，几乎能杀死稻田中包括水稻在内的所有植物，且长期使用杂草也不容易产生抗药性[3]。因此，培育抗草铵膦或/和草甘膦的转基因水稻是解决直播稻草害最高效、最环保的途径。

1.1 抗除草剂水稻新种质Bar68

不抗除草剂的不育系与抗除草剂的恢复系配组，产生的F1杂交种也抗除草剂。利用杂交种的抗除草剂特性，喷施除草剂清除杂交种中混杂的不育系，可以保证大田杂交种纯度，消除杂交种中不育系混杂带来的种子质量问题[5]。香两优68是我国审定的第一个两系杂交早稻品种，解决了过去三系杂交早稻熟期长、品质差的问题。但是，其不育系香125S的不育临界温度至少为24 ℃，制种过程中遇到低温很容易自交结实。用抗除草剂基因Bar转化其恢复系D68，获得抗除草剂草铵膦的恢复系Bar68，不仅能利用其抗除草剂的特点消除杂交种中不育系混杂、保障大田杂交种的纯度，而且适合直播、方便除草[6]。抗除草剂杂交早稻香125S/Bar68与香两优68性状相似，具有熟期适中、产量高、抗性较好、品质较优的特点。2002—2008年相继进行了转基因抗除草剂水稻Bar68的中间试验、环境释放和生产性试验，并分别于2008年和2010年2次申报安全证书（表1～2），但均因政策原因没有获准[7]。抗除草剂水稻Bar68的培育成功，标志着我国在抗除草剂早籼稻恢复系新种质培育方面取得了突破性的进展。

表1 抗除草剂杂交早稻香125S/Bar68-1的生产性试验结果Table 1 Productive trial of Xiang125S/Bar68-1, a glufosinate resistance hybrid for early cropping season

表2 转基因抗除草剂水稻Bar68的安全评价历程Table 2 Process of safety assessment for the glufosinate resistance rice Bar68

1.2 抗两种除草剂的水稻新种质EB7001S

来源于土壤农杆菌CP4菌株的草甘膦抗性基因Epsps在密码子使用偏爱性方面与水稻存在较大差别，直接在水稻中表达效率不高。按照水稻密码子偏爱性优化该基因，其中消除了1处AT富含区序列、改变碱基163个、优化密码子138个、G+C含量降为59.94%[8]。将抗草铵膦基因Bar和优化的抗草甘膦基因Epsps#转化水稻不育系7001S，获得了世界上第一例同时耐受草甘膦和草铵膦的抗除草剂水稻新种质EB7001S[9]。利用hiTAIL-PCR方法分析，发现目标基因插入水稻基因组第7号染色体的1470725位；以左右旁侧序列为基础，建立了转基因水稻EB7001S的事件特异性检测方法和基因型鉴定方法[10]。进一步的中间试验（农基安办字2013-T449）和环境释放试验（农基安审字〔2015〕第30号）表明，它耐受草甘膦的浓度至少为10 g/L、耐受草铵膦的浓度至少为4 g/L。同时抗草铵膦和草甘膦的转基因水稻新种质培育成功，可以实现草铵膦和草甘膦在稻田的交替使用，避免长期使用单一除草剂带来的杂草抗性风险，以及土壤中除草剂残留的长期积累，具有重要的生产应用和环保价值。

1.3 新型抗草铵膦基因和转基因抗除草剂水稻新种质创制

Bar基因是常用的抗草铵膦基因，它不仅被广泛用作遗传转化的筛选标记，而且常用于抗除草剂作物的培育。Pat基因是另一种发现较早的抗草铵膦基因，它和Bar的同源性较高，也已广泛应用于抗除草剂作物的研发[11]。但是，来源于细菌的原始Pat基因不仅密码子偏爱性与水稻不同，而且起始密码子也与水稻的不同，在水稻中直接表达没有生产应用价值。人工优化的Pat#基因密码子使用偏爱性与水稻相同，起始密码子由GTG改为ATG，G+C含量从69.75%降为61.41%，消除了多处mRNA发夹环结构，起始自由能的绝对值降低，其转基因水稻植株对草铵膦的耐受浓度达到2 g/L[12]。

Mat基因是一类新的抗草铵膦基因，它与Bar和Pat基因的序列同源性不高。来源于细菌的原始Mat基因在水稻中直接表达也没有生产应用价值。人工优化的Mat#基因密码子使用偏爱性与水稻相同，G+C含量降为60.11%，mRNA二级结构得到优化，其转基因水稻植株对草铵膦的耐受浓度至少为1 g/L[11,13]。这些新型抗除草剂基因的利用和抗除草剂水稻的创制，扩展了抗除草剂基因的来源、丰富了抗草铵膦水稻的种质库。

1.4 抗除草剂、品质改良水稻新种质的创制

国际上，把转化得到单一外源性状的称为第一代转基因作物，把具有多种外源性状的称为第二代转基因作物，把具有多种外源性状、且包含对消费者有利的外源性状的称为第三代转基因作物。抗除草剂转基因水稻的种质创新也将遵循这个发展规律。

植酸酶能水解植酸磷复合物，并释放肌醇、无机磷及被植酸螯合的一些微量元素，具有提高人和单胃动物对食物中磷及金属离子的利用率、减少磷从粪便中排放污染环境的作用。抗菌肽是生物体产生的具有抗菌活性的小分子肽类的总称。牛乳铁蛋白肽是迄今发现的抗菌抑菌活性最高的抗菌肽之一，对维持肠道健康、提高免疫力具有重要作用。以Bar基因作为筛选标记基因，将植酸酶-牛乳铁蛋白肽融合基因PhyLf导入水稻并在其胚乳中特异表达，获得了植株抗除草剂、种子具有植酸酶和抗菌肽活性的转基因水稻新种质BPL9K。体外检测结果表明，其种子中植酸酶活性最高达到32.30 U/g，种子提取蛋白液经肠激酶消化后具有抑菌活性[14,15]。植酸酶-牛乳铁蛋白肽融合基因是一个人工合成的新基因，也是迄今为止第一次有人将这2个基因融合并在水稻中表达。如能在单胃动物体内验证该转基因稻谷具有植酸酶和抗菌肽的功效，它将一举解决饲料中需要添加植酸酶和抗菌素的两个问题，起到提高饲料中磷的利用率、减少粪便中磷的排放、消除抗生素滥用的作用，具有重要的生产应用价值。

2 抗螟虫、抗除草剂水稻新种质的创制

螟虫是危害水稻的主要害虫。水稻中至今没有发现高抗螟虫的种质资源。当前，控制水稻螟虫危害只能依靠高毒杀虫剂阿维菌素和水胺硫磷、中等毒性杀虫剂毒死蜱等化学农药。苏云金杆菌产生的Bt蛋白质对二化螟、三化螟、大螟、稻纵卷叶螟等水稻鳞翅目害虫具有毒杀作用，利用基因工程技术向水稻中导入Bt抗虫基因，是创制抗螟虫水稻新种质的唯一有效途径。

2.1 抗虫基因Cry2Aa的优化和抗虫、抗除草剂水稻新种质创制

来源于苏云金杆菌的原始Bt基因在水稻中表达不强，需要对原始Bt基因进行改造才能在水稻中高效表达。Cry2Aa蛋白与常用的Cry1A蛋白序列同源性不高，可避免靶标害虫的交互抗性。人工优化的Cry2Aa#基因的GC含量从34.81%提高到57.3%，消除了4处潜在的内含子切割识别序列和在真核生物中影响mRNA稳定的序列，mRNA的总自由能绝对值降低了23.9 kcal/mol，密码子使用的偏爱性与水稻相同[16-17]。

B2A4008S是以Bar基因为筛选标记基因、转化人工优化的Cry2Aa#基因获得的抗除草剂、抗虫水稻不育系新种质。它高抗稻纵卷叶螟、耐草铵膦，保持了光温敏核不育水稻的育性转换特性[18]，是世界上第一例抗除草剂、抗螟虫水稻不育系。

B2A68是以Bar基因为筛选标记基因、转化人工优化的Cry2Aa#基因获得的抗除草剂、抗虫早籼稻新种质。抗虫试验结果表明，转基因水稻B2A68及其杂交组合对稻纵卷叶螟、大螟等鳞翅目害虫表现高抗[19-20]。利用hiTAIL-PCR方法分析，发现目标基因插入水稻基因组第3号染色体非编码区；以左右旁侧序列为基础，建立了转基因水稻B2A68的事件特异性检测方法和基因型鉴定方法[21-22]。采用ELISA检测法，揭示了B2A68纯杂合基因型、不同组织及不同发育时期叶片中Cry2Aa蛋白的时空表达特征[23]。

2.2 抗虫基因Cry1Ca的优化和抗虫、抗除草剂水稻新种质创制

Cry1Ca蛋白是与Cry1A、Cry2A蛋白序列同源性不高的另一类Bt杀虫蛋白。人工优化的Cry1Ca#基因的GC含量从36.51%提高到55.47%，消除了23处AT富含区序列和18处内含子剪切信号位点，不存在潜在的Poly(A)加尾信号位点和常用的酶切位点，密码子使用的偏爱性与水稻相同[24]。

B1C893是以Bar基因为筛选标记基因、转化人工优化的Cry1Ca#基因获得的抗除草剂、抗虫水稻新种质。ELISA检测发现，B1C893根系中Cry1Ca蛋白的表达量最低，叶片中最高，达到35.073 μg/g叶片鲜重。抗除草剂和抗虫生物测定结果显示，B1C893对除草剂草铵膦和稻纵卷叶螟均具有很好的抗性[25]。利用hiTAIL-PCR方法分析，发现外源基因的插入位点位于水稻第8号染色体上第25981位。根据插入序列的特点，我们建立了转基因水稻B1C893事件特异性检测方法和基因型鉴定方法[26]。

以携带抗褐飞虱基因Bph14、Bph15和抗白叶枯病基因Xa23的水稻恢复系R106为受体，采用农杆菌介导法转化抗除草剂基因Bar和抗螟虫基因Cry1Ca#，创制出了抗褐飞虱、抗白叶枯、抗螟虫、抗除草剂草铵膦的四抗水稻新种质B1C106[27]。这是迄今为止水稻内源抗性和外源抗性聚合最多的多抗水稻新种质。

3 耐旱、耐低温、耐盐和抗除草剂水稻新种质的创制

中国本来就人多地少，经济建设对优质耕地的蚕食使得维持水稻种植面积极为艰难。因此，利用不良土壤和不良气候地区土壤种植水稻，是保证水稻播种面积、维持稻谷产量、保障口粮安全的重要途径。创制耐旱、耐盐、耐低温水稻新种质，是利用这些不良耕地种植水稻的基础工作。

干旱响应转录因子DREB （dehydration responsive element binding protein）能特异地与干旱反应原件结合，诱导许多下游逆境基因的表达，产生对干旱、低温及高盐等逆境的响应。我们分别克隆了拟南芥和荠菜的AtDREB1A和CbDREB1A基因[28]。以Bar基因作为筛选标记，转化AtDREB1A基因[29]和CbDREB1A基因[30]的粳型光温敏核不育系4008S均表现出耐旱性增强、且抗除草剂草铵膦。

OsbHLH1基 因 编 码bHLH（basic helix-loophelix）类转录因子，与水稻耐寒性相关。利用Bar作为筛选标记基因，将OsbHLH1基因转化粳稻品种东稻3号，获得的转基因水稻抗除草剂草铵膦、低温条件下光合速率的下降率显著低于非转基因对照，说明增强了转基因水稻耐低温的能力[31]。利用Bar作为筛选标记基因，将OsbHLH1基因转化粳稻恢复系淮C17，获得的转基因水稻芽期、苗期的耐低温能力增强，且抗除草剂草铵膦[32]。

甜菜碱在植物中的积累可以提高植物耐旱、耐盐能力。植物体内甜菜碱的合成途径为胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱。其中第一步由CMO（choline monooxygenase）催化完成，第二步由BADH（betaine aldehyde dehydrogenase）催化完成。利用Bar作为筛选标记基因，将山菠菜胆碱单加氧酶基因（AhCMO）转化粳稻品种东稻3号，获得的转基因水稻抗除草剂草铵膦、耐盐能力强于非转基因对照[33]。利用Bar作为筛选标记基因，将山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因（AhBADH）转化籼稻不育系P88S，获得的转基因水稻抗除草剂草铵膦、耐盐能力明显高于非转基因对照[34]。

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP3主要参与盐胁迫、渗透胁迫和氧化胁迫的响应，能提高抗氧化能力、减轻由NaCl和PEG处理引起的氧化损伤。利用Bar作为筛选标记基因，将GmPAP3基因转化粳稻品种吉粳88，获得的转基因水稻在盐胁迫条件下的种子萌发率、芽长和根长、幼苗成活率均比非转基因对照高，且抗除草剂草铵膦[35]。

4 抗褐飞虱、抗白叶枯病水稻新种质的创制

水稻白叶枯病与褐飞虱是国内外稻作区经常发生的2种重要病虫害。长期生产实践证明，选育与利用抗性品种是防治白叶枯病、褐飞虱最有效、经济、安全的途径。但是，目前广泛使用的杂交稻亲本Y58S、广占63S、荣丰A、华占、岳恢9113等均不抗这2种重要病虫害，所配的杂交稻整体抗性水平低，急需进行改良。

4.1 优良恢复系华占、岳恢9113的白叶枯病和褐飞虱抗性改良

华占和岳恢9113是目前我国水稻生产上应用较多的杂交稻恢复系，可与两系及野败型三系不育系配组，所配的组合产量高、米质优、适应性广。目前，以它们为父本配制的组合C两优343、天优华占、岳优9113在南方稻区的推广面积大，已分别成为湖南省一季晚稻、双季迟熟晚稻和双季中熟晚稻的区试对照品种。但是它们的褐飞虱和白叶枯病抗性差，既存在病虫暴发风险，也严重限制了它们的推广应用范围。

将抗白叶枯病基因Xa23和抗褐飞虱基因Bph14、Bph15同时聚合到强优恢复系华占背景中，获得了3个基因均纯合的15个改良恢复系品系，其白叶枯病抗性水平从至少中感提高到了高抗，褐飞虱抗性水平从6.3级提高到≤3.0级。天丰A与15个改良恢复系配制的15个组合与对照组合天优华占相比，其白叶枯病抗性水平从至少中感提高到了高抗，褐飞虱抗性水平从5.0级提高到≤3.0级，其中组合天丰A/R43-06和天丰A/R43-07的2年小区平均产量高于对照天优华占，具有较好的生产应用前景[36]。

以岳恢9113为轮回亲本，分别获得了含纯合抗白叶枯病基因Xa21和抗褐飞虱基因Bph14、Bph15的改良恢复系品系7个。所有改良恢复系及其与C815S所配组合，除对FuJ菌株（R8小种）表现感病外，对其余接种菌株均表现中抗以上抗性水平，对白叶枯病的抗谱及抗性水平较未改良的岳恢9113及对照组合C两优343均显著改良。苗期抗褐飞虱鉴定结果表明，所有改良恢复系及其与C815S所配组合均表现抗或高抗褐飞虱，褐飞虱抗性明显强于未改良的岳恢9113及对照组合C两优343。农艺性状与小区产量测定结果表明，改良恢复系所配组合C815S/BX9113-01和C815S/BX9113-12产量较高、抗性较好，具有较好的生产应用价值[37]。

4.2 优良不育系Y58S、广占63S和荣丰B的白叶枯病和褐飞虱抗性改良

Y58S、广占63S、荣丰A是当前杂交稻育种中广泛应用的两系与三系不育系。迄今为止，Y58S为母本配制的组合有78个通过了国家或省级品种审定，广占63S为母本配制的组合有16个通过了国家或省级品种审定，荣丰A为母本配制的组合有22个通过了国家或省级品种审定（http://www.ricedata.cn/variety/）。但是，这些组合均表现为感白叶枯病与褐飞虱，既存在病虫暴发的风险，也限制了它们的推广应用范围。

以Y58S、广占63S为轮回亲本，采用分子标记辅助选择与表型鉴定技术相结合，分别获得了含纯合抗白叶枯病基因Xa21和抗褐飞虱基因Bph14、Bph15的改良不育系科BX58S-2和科BX63S-2。孕穗期剪叶接种5个致病力强的白叶枯病菌株，结果显示，科BX58S-2和科BX63S-2除对FuJ菌株表现感病外，对其余4个菌株均表现中抗以上抗性水平，而未改良的Y58S和广占63S对全部菌株均表现感病。苗期褐飞虱抗性鉴定结果表明，科BX58S-2和科BX63S-2抗褐飞虱级别均为3.67级，抗性水平明显高于Y58S（7.67级）与广占63S（9.00级）。此外，改良不育系科BX58S-2和科BX63S-2的不育临界温度低、异交特性好、配合力高，显示出了很好的应用前景[38]。

以保持系荣丰B为轮回亲本，利用分子标记辅助回交技术获得了含抗褐飞虱基因Bph14和Bph15且株叶形态较好的改良株系9个。苗期褐飞虱抗性鉴定结果表明，改良保持系的褐飞虱抗性级别从9.00级（荣丰B）提升到了至少2.33级。连续成对回交产生的不育系鉴定结果表明，由改良保持系科Bph18B-2（B6-11）获得的不育系科Bph18A-2花粉败育彻底、株叶形态好，具有较好的应用价值[38]。

5 耐高温、耐干旱新种质挖掘与耐涝新种质创新

水稻虽属喜温作物，但抽穗期35 ℃以上高温和干旱对花粉育性和结实率影响很大，严重影响水稻产量。爪哇稻的耐旱、耐热性较强。以20%PEG-6000作为渗透介质模拟干旱条件，芽期处理籼爪交重组自交系群体RIL47的270个株系，从中筛选出了最耐旱株系47-274和最敏感株系47-299[39]。利用籼爪交重组自交系群体RIL47的254个株系为材料，在抽穗扬花期进行高温处理，筛选出5个耐高温株系（07H1619、07H1590、07H1521、07H1706、07H1608）和3个高温敏感株系（07H1751、07H1710、07H1719）[40]。通过人工气候室鉴定和分期播种试验，对来自不同国家和地区的95份爪哇稻资源进行抽穗开花期耐高温特性评价，筛选出了3份抽穗期耐高温爪哇稻新种质（IRAT109、260和L4-34）[41]。

抽穗开花期高温对34份东北粳稻花粉育性和结实率的影响研究结果表明，东稻2号、东农03-33、东农415-1、合江195和吉粳3的高温适应性较强[42]。对这5个抽穗期高温适应性较强的东北粳稻进行分期播种试验，从田间农艺性状表现和各材料结实率与自然温度之间的关系来看，东稻2号和合江195可以较好的抵御初夏高温、作为早稻在湖南种植[43]。

水稻是半水生植物，长期深水涝渍会严重影响其生长，较长时间没顶淹涝会导致植株死亡。FR13A是世界上最耐淹的水稻品种，但是它秆高、感光、农艺性状差，没有直接利用价值。利用根据耐涝基因Sub1的序列开发出了1个共分离的分子标记Sub1-1，同时在耐淹涝鉴定时采用2次淹涝法进行淹涝胁迫处理，创制出了1个耐淹涝、苯达松敏感的光温敏核不育系Sub-1BS，它可作为耐涝育种的中间材料使用[44]。

6 展望

矮秆水稻种质资源的发现和利用，实现了水稻产量的第一次飞跃。野败细胞质雄性不育株的发现，奠定了水稻杂种优势利用的基础，成就了水稻产量的第二次飞跃。可见，优异种质的挖掘和创新是一项至关重要的基础性工作。分子生物学、功能基因组学和育种学的发展，使得水稻产量水平大大提高，水稻超高产品种的产量潜力已经达到亩产1 000 kg（15 t/hm2）以上。今后，依靠单个基因来显著提高水稻产量的道路将越来越艰难。提高水稻产量潜力需要高产、多抗、高效性状的紧密配合，提高稻田产出效益需要高产、多抗、高效、优质性状的全生产过程协同。近10年来，国审水稻品种中高产品种的比率一直保持在70%以上，国审水稻品种的总体优质比率达到49.9%，但抗性品种比率不到30%[45]。可见，在保持高产和优质的前提下，提升水稻品种的抗性是今后需要补齐的短板，我们创制的水稻耐逆境新种质将在提升水稻品种抗性中发挥重要作用。

值得特别指出的是，由于政策限制，转基因性状并不包含在现在的推广水稻品种之中，一旦政策放开它们将释放出巨大的红利。例如，抗除草剂性状方便除草，是直播栽培中急需的优异性状，可以大幅度提高生产效率、降低成本；抗螟虫性状可以避免使用高毒或中毒农药，将减少农药成本和环境污染风险。此外，生产植酸酶-抗菌肽融合蛋白的水稻不仅能解决养殖业中存在的抗生素滥用和高磷粪便排放污染环境两大难题，而且将大幅度提升水稻的附加值，具有诱人的应用前景。从当前实用的角度考虑，培育聚合多种耐逆境性状的新种质、新品种将是今后要重点突破的主攻方向。从创新和引领的角度考虑，生产具有特殊功能蛋白质的分子农业将是未来要重点发展的新领域。