Th9和Th22细胞及其细胞因子在儿童支气管哮喘发病中的作用

李 志，冷 峰，杨婷婷，李文哲，王 波，薛邦禄

(1.大连市中心医院 检验科,辽宁 大连116033；2.大连医科大学基础医学院, 辽宁 大连116044)

支气管哮喘(bronchial asthma)是一种儿童常见的变态反应性疾病，发病率多年来一直保持着上升。最新流行病学统计显示，支气管哮喘患儿发病率逐年升高，总发病率与10年前相较升高了43.4%，与20年前相较升高了147.9%[1,2]。由于小儿支气管哮喘的病理过程非常复杂，尚无十分明确的发病机制，最常见的是由IgE作为媒介传导而产生的气道变态性反应，除此之外还和神经、免疫、内分泌环境、精神和遗传学等因素密切相关。

在传统的变态反应型支气管哮喘中，机体免疫调节功能异常为哮喘发作的主要因素，Th1/Th2细胞之间的平衡失调导致的Th2细胞占据主要地位被认为是最为经典[3]。除了传统上的CD4+初始T细胞亚群：Th1、Th2、Treg和Th17等细胞外，近年来，多种新型CD4+T细胞亚群的发现进一步完善了Th1/Th2平衡失调理论。国内外学者通过大量研究从而发现多种辅助性T细胞均参与儿童支气管哮喘的病理过程并在其中扮演着重要角色。CD4+初始T细胞在IL-4与TGF-β共同存在的情况下能够产生一种IL-9+IL-10+Foxp3-的T细胞，即Th9细胞。Th9细胞主要分泌的IL-9在支气管哮喘的呼吸道炎症中能够提高IgE的分泌量，促进气道高反应性的发生，在细胞的分化、增殖、细胞间信息传达等方面都存在重要调节意义。Th22细胞是一种和Th17、Th9等细胞都不同的独立Th细胞，不同的炎症介质和Th22细胞的配体依赖转录因子AHR能够调节CD4+T细胞亚群对IL-22的表达。IL-22可以增强呼吸道修复上皮功能，缩小哮喘患者炎症范围，从而保护肺部组织、减轻支气管炎症。

本研究主要通过检测支气管哮喘患儿的外周血Th9和Th22细胞的比例以及血清中IL-9、IL-22和总IgE的表达，并分析这些细胞及其细胞因子与哮喘严重程度之间的关系，进一步的讨论Th9和Th22细胞在哮喘临床诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取2016年1月至2017年3月在大连市中心医院就医的哮喘患儿56例，依据哮喘患儿发病的严重程度分为两组：哮喘发作组和哮喘缓解组。哮喘的诊断均符合2016年中华医学会儿科学分会呼吸学组修订的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》诊断标准[4]。其中，哮喘发作组共32例，男15例，女17例，年龄3-14岁，平均(6.65±2.57)岁；哮喘缓解组共24例，男9例，女15例，年龄3-12岁，平均(5.49±2.18)岁。另选20例健康儿童作为健康对照组，其中男12例，女8例，年龄3-12岁，平均(5.9±2.31)岁。所有儿童一个月内均未使用糖皮质激素及其他免疫抑制剂，经检查排除患有肺部疾病的可能并排除合并肾小球肾炎及鼻炎、荨麻疹等变态反应性疾病史和其他相关慢性疾病。三组对象在一般临床资料方面均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1主要试剂

FITC标记-抗人CD4单克隆抗体、IntraPrepTM固定剂和破膜剂购自美国Beckman公司；PE标记-抗人IL-9抗体、PE标记-抗人IL-22抗体及同型对照IgG1-PE购自美国Affymetrix e-Bioscience公司；淋巴细胞分离液、RPMI-1640培养基、佛波醇酯类多克隆刺激剂(PMA)、钙离子载体离子霉素(Ionomycin)、蛋白转运阻抑剂莫能霉素(monensin)购自美国Sigma-Aldrich公司；人IL-9和IL-22 ELISA定量试剂盒购自美国R&D公司。

1.2.2主要仪器设备

流式细胞仪：CytomicsTMFC 500；特定蛋白分析仪：IMMAGE 800，购自美国Beckman公司。Sunrise酶标仪：购自奥地利Tecan公司。

1.3 标本采集和处理

采集受检者清晨空腹静脉血各3 ml于EDTA抗凝管和促凝管中，所有标本均来自于临床诊断所用标本，无乳糜或溶血现象。

1.3.1分离单个核细胞(PBMCs) 在无菌离心管中加入适量的人淋巴细胞分离液，将磷酸盐缓冲液(PBS)与抗凝血1∶1混合稀释，沿管壁缓慢加于分离液上。经2 000 r/min离心20 min后，用毛细吸管从中间吸取单个核细胞，置入事先准备好的离心管中。

1.3.2分离血清 待促凝管中血液凝固后，经3 000 r/min离心5 min，取上层血清分为两份，一份送至检验科免疫室检测血清总IgE的含量，另一份置于-70℃冰箱冷冻保存用于ELISA试验检测细胞因子IL-9和IL-22的含量。

1.4 实验方法

1.4.1Th9和Th22细胞的流式检测

(1) 重悬细胞：在分离出的PBMCs中加入PBS，经1 500 r/min离心10 min，洗涤细胞两次。末次洗涤后，弃上清，重悬于RPMI-1640培养液中(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素)。

(2) 胞外染色：根据单抗试剂说明，在收集的细胞内加入CD4-FITC单抗，混匀后避光孵育20 min。

(3) 细胞培养：将染色后的PBMCs悬液加入24孔培养板内培养，每孔1 mL，培养孔中加入终浓度为50 μg/L PMA、离子霉素1 μg/mL、3 μmol/L莫能霉素的混合液。将细胞浓度调整至1×106/mL，置入37℃的5%二氧化碳培养箱孵育。4 h后取1 ml细胞悬液至流式管中，2 000 r/min离心8 min，弃上清，PBS洗2次。

(4) 固定破膜：洗涤后的细胞悬液用试剂IntraPrepTM进行固定和破膜。加固定剂500 μl，振荡后避光孵育15 min，加PBS离心洗涤，弃上清，加破膜剂500 μl，轻轻混匀，避光孵育5 min。

(5) 胞内染色：将破膜后的悬液经PBS洗涤2次后平均分成4管，分别加入IL-9-PE、IL-22-PE和同型对照IgG1-PE各10 μl，避光孵育30 min，PBS洗涤2次后加入500 μl的PBS重悬。

(6) 流式检测：应用CytomicsTM FC 500流式细胞仪检测标记的各淋巴细胞胞膜及细胞因子的荧光强度，界定CD4+IL-9+为Th9细胞，CD4+IL-22+为Th22细胞。

1.4.2特定蛋白分析仪检测血清中总IgE的含量

分离出的血清采用IMMAGE 800特定蛋白分析仪以及相应的配套原装试剂进行上机检测总IgE含量。

1.4.3ELISA检测血清中IL-9和IL-22的含量

严格按照各ELISA试剂盒操作说明进行操作。在450 nm波长下，用酶标仪测定实验血清中细胞因子IL-9和IL-22及各标准品的OD值，计算出血清中IL-9和IL-22浓度。

1.5 数据处理

用流式细胞仪所测得的Th9和Th22细胞所占细胞百分比以及用ELISA试剂盒所测得的血清中IL-9和IL-22的浓度，均采用SPSS 22.0系统软件进行统计学分析，数据以“x—±s”表示，两组间数据采用独立样本t检验；采用Pearson检验进行直线相关性分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 支气管哮喘患儿外周血中Th9和Th22细胞的表达

哮喘发作组患儿外周血中Th9和Th22细胞表达比例与哮喘缓解组、健康对照组相比显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。哮喘缓解组患儿外周血中Th9和Th22细胞表达比例与健康对照组相比显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组儿童外周血中Th17、Th9和Th22细胞表达比例

注：a：与哮喘缓解组、健康对照组相比，P<0.05；b：与健康对照组相比，P<0.05

2.2 支气管哮喘患儿血清中IL-9、IL-22和总IgE的水平

哮喘发作组患儿血清中IL-9、IL-22和总IgE的水平与哮喘缓解组、健康对照组相比显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。哮喘缓解组血清中IL-9、IL-22和总IgE的水平与健康对照组相比显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组儿童血清中IL-17、IL-9、IL-22和总IgE的含量

注：a：与哮喘缓解组、健康对照组相比，P<0.05；b：与健康对照组相比，P<0.05

2.3 支气管哮喘患儿血清中IL-9、IL-22与总IgE水平相关性分析

在哮喘发作组中，支气管哮喘患儿血清中IL-9、IL-22与总IgE水平均呈正相关(r=0.491，r=0.786，P值均<0.05)。见图1、图2。

图1 支气管哮喘患儿血清中IL-9与总IgE水平呈正相关

图2 支气管哮喘患儿血清中IL-22与总IgE水平呈正相关

3 讨论

儿童支气管哮喘是一种由于机体免疫调节功能紊乱导致的慢性气道炎症。儿童由于免疫系统发育受限，CD4+T细胞各亚群的表达也和成年人有所不同。既往认为Th1细胞是支气管哮喘的保护因素，在众多哮喘病理机制中Th1/Th2细胞平衡失调导致的Th2细胞占主要地位被认为是最为经典的。但研究发现该失衡理论与实验结果有出入，阻断Th2类细胞因子并不能有效的缓解哮喘，因此不能完全解释支气管哮喘的病理机制[5]。支气管哮喘主要是由IgE作为媒介传导的气道过敏性反应，IgE的水平变化与支气管哮喘的诱发以及轻重程度有很大的关系。国外研究调查显示，在支气管哮喘的发病过程中，59%左右的哮喘为中性粒细胞型，而仅有41%的哮喘为嗜酸粒细胞型，儿童哮喘大多为中性粒细胞型[6]。

一直以来，IL-9一直被看做是Th2细胞分泌的相关因子，直至2008年Th9细胞以一种独立新型CD4+T细胞的身份被发现。虽然Th2细胞也可以分泌IL-9但分泌量远不及Th9细胞多。人类Th9细胞与鼠类不同，主要表达IL-9，而并不表达IL-10[7]。IL-9对淋巴B细胞有直接作用，能够共同与IL-4调控IgE合成；诱导中性粒细胞增殖，从而释放IL-8通过正反馈调节来招募更多中性粒细胞；促使肥大细胞增殖，产生炎症介质[8]。有研究发现，IL-9可增强骨髓祖细胞对IL-5受体α链的表达能力，同时调节一些趋化因子Eotaxin等来促进嗜酸粒细胞前体在肺部的的分化、成熟和聚集，参与哮喘发病[9]。本次研究结果显示，哮喘发作组及哮喘缓解组外周血Th9及相关细胞因子IL-9的水平与健康对照组相比均显著升高，支气管哮喘患儿血清中IL-9与总IgE水平之间呈正相关，这与黄璇[10]等人的结果相一致。这提示了Th9及细胞因子IL-9与支气管哮喘患儿疾病严重程度之间呈正相关，这可以作为哮喘活动期的一种重要标志。国外学者通过评估阻断IL-9对慢性气道炎症的影响发现，抗IL-9抗体可以减少由于慢性气道炎症和气道重塑导致的细胞浸润[11]。抗IL-9抗体可以减少Th17细胞、Th9细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞以及肥大细胞的数量并抑制细胞因子的合成和分泌，减少IgE在淋巴B细胞中的合成，这为今后儿童支气管哮喘的医治提供了新途径。

不同于Th17、Th9等细胞Th22细胞是一种以分泌IL-22为主的的新型CD4+T细胞。不同的炎症介质和Th22细胞的配体依赖转录因子AHR能够调节CD4+T细胞亚群对IL-22的表达。TNF-α，IL-6和活性维生素D都被认为能够增强Th22细胞对IL-22的表达[12]。在气道嗜酸性炎症中，IL-22可以与TNF-α一同诱导信号转导抑制肺上皮细胞产生IL-25，改变树突状细胞的功能并来抑制气道过敏性炎症反应[13]。与此同时，研究发现[14]，不同研究者对于IL-22在哮喘中的作用持有“促炎”和“抑炎”两种不同的观点：有学者在小鼠的哮喘模型中发现，经OVA致敏、激发后，IL-22敲除后小鼠与野生型相比气道过敏性反应明显增强、气道的反应性增高；但也有学者经研究后认为，在慢性中重度哮喘患儿外周血中IL-22 mRNA表达明显升高，与此同时其含量与血清总IgE水平之间呈正相关。张旃[15]等通过临床研究发现，IL-22在哮喘中究竟发挥的“促炎”还是“抑炎”作用取决于其表达的阶段和组织微环境：在气道平滑肌细胞的分化成熟过程中浓度的高低具有决定性的意义，细胞在高浓度的IL-22存在下增殖能够被显著抑制，而在低浓度的时候则恰恰相反；对于气道成纤维细胞来说，在哮喘后续阶段，IL-22的效果微乎其微。对于人气道的上皮细胞，IL-22有双重影响：在哮喘发生的启动阶段，气道上皮细胞在IL-22的作用下能够加速坏死进程，从而达到抑制分化增殖、促进气道炎症的目的；但在后续阶段IL-22则可能具有保护组织的作用[16]。本研究显示，与哮喘缓解组、健康对照组相比，哮喘发作患儿体内Th22及其相关细胞因子IL-22的分泌明显升高，血清中IL-22与总IgE水平之间呈正相关，这和施灵敏[17]等人的研究结果相符。提示Th22及相关细胞因子IL-22参与了哮喘的发病过程并与哮喘患儿疾病严重程度相关。

综上所述，支气管哮喘患儿外周血中Th9和Th22及其相关细胞因子是小儿支气管哮喘的发病过程中的重要角色，为高级免疫干预治疗提供了新可能性。临床上可以通过检测哮喘患儿体内细胞因子水平变化并结合哮喘患儿的临床表现来进行病情的评估，进而可以探讨能否使用细胞因子相关的拮抗剂或者调控剂来辅佐治疗儿童哮喘，为哮喘患儿的初期诊断和初期治疗提供科学的手段。