咪喹莫特对哮喘大鼠血清TIM-3及肺组织CXCR4表达的影响*

2018-11-26杨丽霞贾钦尧蒋莉董琼

西部医学 2018年11期

杨丽霞贾钦尧蒋莉董琼

(1.川北医学院第二临床医学院· 南充市中心医院呼吸内科，四川南充637000；2.川北医学院药学院药物研究所，四川南充637000)

支气管哮喘是临床中较为常见的慢性气道炎症性疾病，其中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、肥大细胞、气道上皮细胞等均参与此过程[1-2]。在哮喘的发生及发展过程中，Th17/Treg细胞平衡起到十分重要的作用[2]。相关研究表明[3]，T细胞免疫球蛋白与黏蛋白域蛋白3(T cell immunoglobulin domain mucin domain，TIM-3)是Th17细胞表面特异性有限表达蛋白，其可与Treg细胞表面表达的galectin-9配体特异性结合，在哮喘的发生发展过程中也扮演十分重要的角色。基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)及趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4)是体内重要的趋化因子家族成员，可起到促进血管生成，调节其他细胞因子，趋化炎症细胞表达，并在哮喘疾病进展过程中起到十分重要作用[4-6]。本研究以哮喘大鼠模型作为研究分析，旨在探讨咪喹莫特对哮喘大鼠血清Tim-3及肺组织CXCR4表达的影响。

1 材料及方法

1.1 实验动物及材料选取雌性BALB/C纯系大鼠18只，大鼠均为清洁级，4周龄，体质量16～20g。咪喹莫特购自上海特化医药有限公司，鸡卵白蛋白(OVA，ovalbumin)购自美国Sigma公司。TIM-3及CXCR4检测配套试剂均购买自大连TAKARA公司。低温高速离心机5417R(Eppendorf公司，USA)，酶标仪model680(Bio-rad公司，USA)。7900 RT-PCR仪(ABI公司，USA )。

1.2 分组及建模将所有大鼠依照体质量编号并采用随机数字表法分为空白组、模型组及观察组，每组6只。观察组及模型组大鼠第1d腹腔注射OVA致敏液(400 μg氢氧化铝凝胶和100μgOVA)0.1ml，1周及2周后各以相同剂量注射致敏液，3周后使用OVA溶液10 g/L超声雾化激发，每天30 min，持续刺激1周，大鼠均出现毛发竖立、搔鼻、烦躁、精神差、食欲降低、腹肌抽搐、喘息等症状。观察组在雾化吸入1%OVA溶液前先预先吸入咪喹莫特混悬液1.5 g/L 30 min，持续7d。空白组大鼠在模型组处理同期给予生理盐水干预，21d后使用生理盐水超声雾化激发，持续7d。在观察组大鼠采用咪喹莫特干预后第8d，将各组大鼠处死。

1.3 引物设计所有引物均由南京金斯瑞公司合成，其引物表见表1。

表1 引物表Table 1 Primer sequences

1.4 酶联免疫吸附法检测血清中TIM-3浓度大鼠干预结束后无菌取心脏采血，离心收集血清使用酶联免疫吸附法检测血清中TIM-3水平。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测建模完成后使用10%水合氯醛麻醉，剥离右肺，采用TRIzol法抽提总RNA水平，采用RT-PCR检测组织中SDF-1、CXCR4及β-actin mRNA水平，反应体系20μl，其中cDNA模板2 μl，上下游引物各0.3 μl，SYBR 10μl，灭菌超纯水7.4 μl，采用RT-PCR法检测各指标mRNA水平。并取3～4只完整右侧中叶支气管，采用ImageJ测定支气管管腔内周长、支气管平滑肌面积、管壁面积、平滑肌细胞核数，将测得值使用所选取的管腔内周长行标准化，后取均值。

2 结果

2.1 支气管评估结果空白组、模型组及观察组大鼠支气管壁面积、支气管平滑肌厚度及平滑肌细胞核数均有显著性差异(P<0.05)；且观察组大鼠支气管壁面积、支气管平滑肌厚度及平滑肌细胞核数均显著低于模型组(P<0.05)，见表2。

表2 支气管相关指标评估结果Table 2 Results of bronchial assessment

2.2 大鼠血清中TIM-3水平检测结果 3组大鼠血清中TIM-3水平有显著性差异(P<0.05)，且观察组显著低于模型组(P<0.05)，见表3。

表3 大鼠血清中TIM-3水平检测结果Table 3 Survey results of serum TIM-3 level in rats

2.3 各组大鼠肺组织SDF-1及CXCR4表达检测结果 3组大鼠肺组织中SDF-1及CXCR4表达有显著性差异(P<0.05)；且观察组肺组织中SDF-1及CXCR4表达显著低于模型组(P<0.05)，见表4。

3 讨论

哮喘是较为常见的呼吸道疾病,但其发病机制尚未完全揭示。近年来有研究结果显示,在哮喘的发生及发展过程中免疫失衡起到十分重要的作用[7-8]。其中辅助性T细胞失衡是导致该病发生及发展的重要因素[9]。此外，辅助性T细胞可能释放多种细胞因子与气道高反应性和气道炎症密切相关[10-11]。咪喹莫特是近年来研究较广的新型干扰素诱导免疫调节小分子，其是Toll样受体7的特异性配体，可被B细胞、巨噬细胞、树突状细胞及单核细胞抗原呈递细胞识别。当咪喹莫特与细胞表面特异性Toll样受体7结合后，可诱导细胞分泌IFN，抑制Th2细胞因子分泌，促进细胞向Th1细胞分化，有效改善以Th2为主的反应，是治疗哮喘的重要药物之一[12-13]。

Table4ResultsofSDF-1andCXCR4expressioninlungtissueofeachgroup

组别nSDF-1/β-actinCXCR4/β-actin空白组60.14±0.010.24±0.02模型组60.75±0.020.67±0.01观察组60.32±0.020.32±0.02F7.5935.326P0.0000.000

TIM基因是T细胞表面新发现的基因家族成员，而TIM-3是被报道参与T细胞免疫应答成员，其特异性表达在TH17及Th1细胞表面，在T细胞分化过程中起到十分重要的作用[14]。且有研究指出，TIM在自身免疫性疾病、慢性病毒变态反应性疾病过程中均起到十分关键作用[15-16]。有研究指出，大鼠与人体内TIM-3具有相同的基因序列，其氨基酸序列与人存63%的同源性[17]。本研究结果显示，模型组大鼠血清中TIM-3水平显著高于空白组，经咪喹莫特治疗后大鼠血清中TIM-3显著降低，提示咪喹莫特对哮喘大鼠治疗后可有效降低血清中TIM-3水平，提高治疗效果。分析原因，可能是咪喹莫特干预后可有效诱导免疫反应，增强树突细胞抗原呈递，刺激B细胞分化成抗原分泌细胞，抑制IgE合成的同时增强IgG2α合成，刺激天然免疫而有效调控TIM-3水平，降低体内炎性反应。SDF-1是趋化因子家族成员，其在淋巴细胞、单核细胞、内皮祖细胞、嗜酸粒细胞、造血干细胞等细胞上与CXCR4结合，活化后可调节其他细胞因子表达、趋化炎症细胞陈述并促进血管生成[18-19]。有学者研究指出，通过分析大鼠哮喘模型气管壁及肺组织CXCR4及SDF-1水平发现，在哮喘大鼠的气道重塑和气道炎症过程中起到十分重要作用[20]。本研究结果显示，观察组大鼠肺组织中CXCR4及SDF-1均显著升高，而采用咪喹莫特治疗后可显著降低肺组织中CXCR4及SDF-1表达水平。咪喹莫特干预后可有效改善肺组织中CXCR4及SDF-1表达水平，降低气道炎症反应，提高肺组织重塑性。分析认为，采用咪喹莫特干预后，可有效抑制杯状细胞增生，减少粘液分泌量，并改善血管及气管壁周围胶原沉积。此外，咪喹莫特还可有效减少肺组织IL-4及IL-5表达量，增强IFN-γ表达，抑制哮喘气道炎症反应，进而改善肺组织CXCR4及SDF-1表达。