汉防己甲素体外辅助多柔比星杀伤胃癌细胞及机制研究

石 丹马旖旎

胃癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一，很多患者被确诊时肿瘤已发生扩散，因此胃癌的死亡率很高[1]。手术是治疗胃癌的最佳手段，但对于已经发生肿瘤扩散的患者而言，系统性化疗是不可或缺的治疗方案[2]。多柔比星又称为阿霉素，是一种抗肿瘤抗生素，它能嵌入到肿瘤细胞的DNA中，从而抑制RNA和DNA的合成并诱导细胞进入凋亡程序。临床上，多柔比星被广泛用于胃癌、肝癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的治疗，然而多柔比星的毒副反应尤其是心脏毒性较大，因此寻找合适的辅助治疗药物提高胃癌细胞对多柔比星的敏感性以降低多柔比星的使用剂量具有十分重要的意义[3-5]。本研究探讨中药活性成分汉防己甲素是否能辅助多柔比星杀伤胃癌细胞并研究其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人胃癌细胞系MGC-803购于中科院上海细胞库（批号TCHu84），培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37°C恒温培养箱中培养并通入5%CO2。

1.2 试 剂 多柔比星（批号D1515）、汉防己甲素（批号 T2695）、噻唑蓝（MTT，批号 M2128）和凋亡检测试剂盒（批号APOAF）购于德国Sigma-Aldrich。小窝蛋白-1（caveolin-1，批号#3267）、蛋白激酶B（AKT，批号 #4691）、磷酸化 AKT（批号 #4060）、B 淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2）相关细胞死亡激动子（Bad，批号#9268）、磷酸化 Bad（批号 #5284）、B 淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2，批号#4223）、大分子B淋巴细胞瘤蛋白（Bcl-xl，批号#2764）、半胱天冬酶-9（caspase-9，批号 #9502）、半胱天冬酶-3（caspase-3，批号#9665）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，批号#5174）抗体购于美国Cell Signaling。增强化学发光底物显色试剂盒（ECL，批号32106）购于美国Pierce。脂质体2000（Lipofectamine 2000，批号11668019）购于美国Invitrogen。蛋白G免疫共沉淀琼脂糖珠（批号sc-500778）购于美国Santa Cruz。

1.3 caveolin-1真核表达载体的构建及转染 首先通过分子克隆技术将caveolin-1基因的开放阅读框架序列与pcDNA3.1连接后构建成caveolin-1重组质粒。将MGC-803细胞接种在6孔板上孵育过夜，使其贴壁。将终浓度为2μg/mL的caveolin-1重组质粒用Lipofectamine 2000进行包裹后将其加入到无血清培养基进行混合。移去原6孔板中的培养基，并将上述含caveolin-1重组质粒的无血清培养基加入到6孔板中，孵育6h后移去无血清培养基，并加入新鲜的含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养24h。收集细胞用于后续实验。对照细胞为Lipofectamine 2000（含空质粒，终浓度为 2μg/mL）孵育 6h。

1.4 相对细胞活力检测 将MGC-803细胞按5×103/孔接种在96孔板上孵育过夜，使之贴壁进行分组实验。实验分为对照组（空质粒转染但不加药物处理）、汉防己甲素组（2μg/mL汉防己甲素处理），多柔比星组（1μg/mL多柔比星处理）、汉防己甲素+多柔比星组（2μg/mL汉防己甲素+1μg/mL多柔比星联合处理）和汉防己甲素+多柔比星+caveolin-1质粒组（MGC-803细胞用caveolin-1质粒转染并用2μg/mL汉防己甲素+1μg/mL多柔比星联合处理）。细胞培养48h后在每个培养孔中加入0.1mg MTT并将细胞继续置于37°C恒温培养箱中培养4h。小心吸走孔内培养基，加入100μL二甲亚砜，充分震荡混匀后在570nm波长下测定OD值。各组相对细胞活力=药物处理组OD值/对照组OD值。

1.5 免疫共沉淀 按1.4所述进行分组处理MGC-803细胞，之后对MGC-803细胞进行计数，取2×106的各组细胞用免疫沉淀缓冲液进行裂解，缓冲液的成分如下：50mmol/L Tris-HCl（pH7.4），1%NP-40细胞裂解液，150mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA。MGC-803细胞在裂解液下处理15min后，12 000rpm离心10min，收取上清液。将上清液分成等量两份，一份用作内参，另一份进行免疫共沉淀，在其中加入Bad抗体孵育过夜，之后加入蛋白G琼脂糖珠孵育2h。孵育完成后1200rpm离心5min，将琼脂糖珠离心至管底，之后将上清液小心吸去，琼脂糖珠用免疫沉淀缓冲液洗涤2次后加入Western blot上样缓冲液，沸水浴煮5min后备用，用于检测与Bad结合的Bcl-2和Bcl-xl蛋白。

1.6 Western blot试验 用蛋白提取液提取MGC-803细胞中的总蛋白质。将等量的总蛋白质和1.5下所得样品用10%SDS-PAGE进行电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉对PVDF进行封闭孵育2h，之后再将PVDF膜用caveolin-1、AKT、磷酸化AKT、Bad、磷酸化 Bad、Bcl-2、Bcl-xl、caspase-9、caspase-3和GAPDH抗体进行孵育过夜。一抗孵育完毕后的PVDF膜再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

1.7 细胞凋亡试验 按1.4所述分组处理MGC-803细胞，之后对MGC-803细胞进行计数，取2×106的各组细胞按照凋亡检测试剂盒说明书步骤用Annexin-V和碘化丙啶（PI）对细胞进行染色孵育20min，之后用生理盐水洗涤2次，采用流式细胞术检测MGC-803细胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V阳性细胞数占总细胞数的百分比表示。

1.8 统计学方法 所有实验重复3次，应用SPSS16.0软件进行数据统计分析，计量资料用均数±标准差（±s） 表示。多组间均数的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），统计检验方法行Bonferroni校正，进行多组间均数的两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 汉防己甲素对多柔比星辅助抗胃癌活性 MTT实验结果显示汉防己甲素+多柔比星组MGC-803相对细胞活力显著低于汉防己甲素组和多柔比星组（P＜0.05），凋亡率较汉防己甲素组和多柔比星组高，表明汉防己甲素对多柔比星有辅助抗胃癌活性。见表1。

表1 各组MGC-803细胞相对细胞活力和凋亡率比较（±s）

表1 各组MGC-803细胞相对细胞活力和凋亡率比较（±s）

注：与多柔比星组比较，*P＜0.05；与汉防己甲素组比较，▲P＜0.05；与汉防己甲素+多柔比星组比较，△P＜0.05

组别对照组汉防己甲素组多柔比星组汉防己甲素+多柔比星组汉防己甲素+多柔比星+caveolin-1质粒组孔数3 3 3 3 3相对细胞活力1.00±0.07 0.89±0.06 0.79±0.06 0.34±0.03*▲0.71±0.06△凋亡率（%）1.91±0.22 6.92±0.61 12.23±1.13 40.32±3.51*▲15.94±1.22△

2.2 MGC-803细胞caveolin-1可能是汉防己甲素的直接靶点 Western blot实验结果显示，汉防己甲素组、汉防己甲素+多柔比星组MGC-803细胞caveolin-1表达水平、AKT和Bad磷酸化水平均明显低于对照组、多柔比星组（图1），表明caveolin-1是汉防己甲素的直接作用靶点。另外，转染caveolin-1表达质粒能使MGC-803细胞caveolin-1发生强制过表达，废除汉防己甲素对caveolin-1的抑制（图1）。MTT和流式细胞实验结果显示，汉防己甲素+多柔比星+caveolin-1质粒组MGC-803的相对细胞活力显著高于汉防己甲素+多柔比星组，而其细胞凋亡率显著低于汉防己甲素+多柔比星组（P＜0.05）（表 1）。这些结果表明汉防己甲素抑制MGC-803细胞caveolin-1表达从而增强多柔比星的抗胃癌活性。

2.3 汉防己甲素通过caveolin-1/AKT/Bad途径促进多柔比星诱导的凋亡 免疫共沉淀与Western blot实验结果显示，汉防己甲素联合多柔比星组MGC-803细胞Bad与Bcl-xl及Bcl-2结合水平、caspase-9和caspase-3活化水平均高于多柔比星组（图2）。同时，流式细胞实验结果显示，汉防己甲素+多柔比星组MGC-803凋亡率显著高于多柔比星组（P＜0.05）（表 1）。然而，汉防己甲素+多柔比星组 MGC-803细胞Bad与Bcl-xl及Bcl-2结合水平、caspase-9和caspase-3活化水平及凋亡水平均显著低于汉防己甲素+多柔比星+caveolin-1质粒组（图2）。这些结果表明在胃癌细胞中，汉防己甲素可能通过caveolin-1/AKT/Bad途径促进多柔比星诱导的凋亡。

图1 汉防己甲素、多柔比星和caveolin-1质粒处理对MGC-803细胞caveolin-1表达水平及AKT和Bad磷酸化水平的影响

3 讨论

多柔比星是临床上治疗胃癌的重要化疗药物，然而大剂量多柔比星的心脏毒性较大，因此提高胃癌细胞对多柔比星的敏感性以降低多柔比星的使用剂量是目前亟待解决的课题。研究[6-7]发现一些中药活性成分具有一定的抗肿瘤能力，并且联用这些中药活性成分能有效提高化疗药物的疗效。汉防己甲素又名粉防己碱、汉防己碱，是一种提取自粉防己根的双苄基异喹啉生物碱，临床上主要用于关节炎、心律失常、炎症等疾病的治疗。近期研究[8-9]发现，汉防己甲素还具有一定的抗肿瘤活性，如能抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭和转移，又能通过ROS/Notch1信号通路诱导白血病细胞的自噬和分化。本研究发现，尽管汉防己甲素单独处理对胃癌细胞系的杀伤活性较弱，但其能明显增强多柔比星的抗胃癌活性（P＜0.05），表明汉防己甲素可以作为辅助治疗药物增强胃癌细胞对多柔比星的敏感性，提高其疗效。

图2 汉防己甲素通过caveolin-1/AKT/Bad途径促进多柔比星诱导的凋亡（A：汉防己甲素、多柔比星和caveolin-1质粒处理对MGC-803细胞中Bad与Bcl-2及Bcl-xl相互作用的影响；B：汉防己甲素、多柔比星和caveolin-1质粒处理对MGC-803细胞中caspase-9、caspase-3活化水平的影响）

caveolin-1是构成细胞膜小窝的重要结构蛋白，对细胞膜的分子转运、细胞黏附和信号转导起重要作用，能促进肿瘤细胞的生长、存活和转移[10-13]。研究[10-13]表明，caveolin-1在肿瘤细胞中发挥抗凋亡活性，并且caveolin-1和肿瘤细胞的化疗抵抗有关，多药耐药的肺癌、胰腺癌和乳腺癌细胞的caveolin-1都被发现过表达，并且caveolin-1的过表达还和肿瘤患者的不良预后有关，因此，caveolin-1可作为肿瘤治疗的潜在靶点。在caveolin-1的下游通路中，AKT的激活是caveolin-1发挥肿瘤促进作用的重要步骤[14]。Bad是Bcl-2促凋亡蛋白家族成员，是AKT激酶的底物。非磷酸化的Bad能通过与抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl结合，使之失活从而发挥促凋亡作用。然而，当Bad被AKT途径磷酸化后，磷酸化的Bad会从其与Bcl-2或Bcl-xl形成的异二聚体中分离出来，并与14-3-3支架蛋白结合从而失去促凋亡活性[15-16]。本研究结果表明，汉防己甲素能明显抑制胃癌细胞caveolin-1蛋白表达水平，从而抑制胃癌细胞AKT磷酸化通路，使Bad蛋白保持在非磷酸化活性状态中，从而抑制Bcl-2和Bcl-xl的抗凋亡活性，提高胃癌细胞对多柔比星诱导的凋亡通路的敏感性，表现为凋亡执行蛋白caspase-9和caspase-3的显著活化，诱导胃癌细胞发生凋亡性死亡。

综上所述，汉防己甲素可能通过caveolin-1/AKT/Bad途径增强多柔比星对胃癌细胞的凋亡诱导活性。