蒙药朱日很滴丸抗动脉粥样硬化作用的研究

郭俊英，韩瑞兰*，王跃武，曹俊彦，张 谦，邢煜舒

(1.内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010059；2.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心，呼和浩特 010059)

心血管疾病是严重影响人类健康的疾病之一，动脉粥样硬化是心血管疾病的共同病理学基础[1]，可累及冠状动脉、颈动脉、主动脉和肾动脉等大中动脉血管，并最终引发冠心病、心绞痛和心律失常等相关心血管疾病和脑、肾血管疾病[2]，因此，寻找有效治疗动脉粥样硬化疾病的药物是目前药学工作者研究的热点。蒙医药治疗心血管疾病具有有效性、无明显毒性和不良反应的优势[3-4]。蒙药朱日很滴丸原处方系蒙医临床经验方，由广枣、红花、栀子、肉豆蔻、草果、檀香、沉香、阿魏、冰片和牛黄10味药组成。制备方法：按照处方比例称取广枣、红花和栀子，粉碎成粗粉，通过乙醇回流，得醇提物。将上述3种提取物按照处方量折算，与牛黄、冰片混匀，过120目筛，细粉备用。按照处方比例称取肉豆蔻、阿魏、沉香、檀香和草果5味药材，混合粉碎，过10目筛，CO2超临界萃取，得萃取物。按照处方比例混合醇提物、牛黄、冰片和萃取物，与滴丸基质混合，在80 ℃下熔化后，制备滴丸。冷却剂选择二甲基硅油。滴丸成型后取出，除去表面二甲基硅油，包衣，即得。朱日很滴丸具有清心火、化瘀血和改善心功能的作用，用于心慌、气短和胸闷烦躁，临床上主治冠心病、心绞痛和心律失常等，疗效好[5-8]。但其是否具有抗动脉粥样硬化作用尚未见报道。本实验通过建立兔动脉粥样硬化模型，考察蒙药朱日很滴丸抗动脉粥样硬化的作用，为临床用药提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1仪器 BSA224S型电子天平(美国赛多利斯科学仪器有限公司)；Leica ASP200S型封闭式全自动组织脱水机，Leica EG150H型分体式组织包埋机，Leica RM2135型切片机，Leica HI1210型摊片机，Leica AUTO STAINER XL型全自动染色机(德国徕卡公司)；SAPPHIRE600全自动生化分析仪(山东博科生物产业有限公司)。

1.2试药 朱日很滴丸(内蒙古医科大学蒙医药研究院)；羧甲基纤维素钠(天津市光复精细化工研究所)。

1.3动物 普通级日本大耳白兔60只，雌雄各半，体质量2.5±0.3 kg，购自内蒙古医科大学动物生产中心，动物许可证号：SCXK(蒙)2015-0001。

2 方法

2.1分组及给药 将60只日本大耳白兔随机分为溶媒对照组、模型组、朱日很滴丸高、中、低剂量组和普罗布考组，每组10只，雌雄各半。溶媒对照组，普通饲料喂养，其余各组均给予高脂饲料+牛血清白蛋白(在喂养高脂饲料的基础上于第1和4周时耳缘静脉注射牛血清白蛋白，250 mg·kg-1)。第8周造模成功后(第8周，各组兔耳中央动脉采集血液，检测血脂，与溶媒对照组比较，其余各组血脂显著升高)，朱日很滴丸高、中和低剂量组在模型组喂养的基础上，分别灌胃给予朱日很滴丸116，365和1 160 mg·kg-1，普罗布考组在模型组喂养的基础上，灌胃给予普罗布考 26 mg·kg-1，溶媒对照组和模型组在原有喂养方式的基础上，灌胃给予等体积羧甲基纤维素钠，每日1次，连续4周。各组兔均单笼饲养，足量饮食，自由饮水，共喂养12周。

2.2测定摄食量和动物体质量变化 实验开始的第1～2周和7～8周测定各组家兔的摄食量和体质量值。

2.3血清中各指标检测 分别于实验0，4，8和12周时，从兔耳中央动脉采集血液4～5 mL，置于不含抗凝剂的普通采血管中，离心，取血清，用全自动生化仪测定CHOL、LDL、TG和HDL水平。并用12周时取得的血清，按照Elisa试剂盒操作步骤，测定各组血清中IL-6、TNF-α、SOD、MDA和ox-LDL的含量。

2.4主动脉油红O染色测定斑块覆盖率 将解剖所得主动脉用蒸馏水冲洗后，置于油红O染液中浸泡8～10 min，取出，置于体积分数为70%的乙醇中分化后，用蒸馏水冲洗，拍照，用image Pro plus 6.0图像分析软件进行分析，计算斑块覆盖率。

2.5主动脉HE染色分析 给药结束后，向兔耳缘静脉注射空气，形成空气栓塞，将兔处死。取主动脉，置于体积分数为4%的中性甲醛中固定后，经脱水、透明、浸蜡、包埋和切片处理，进行HE染色，光学显微镜下观察。

3 结果

3.1实验动物数量分析 纳入日本大耳白兔60只，死亡7只。溶媒对照组：死亡1只，死亡原因不明；模型组：死亡1只，死于腹泻、厌食；朱日很滴丸低剂量组：死亡1只，将药物灌入肺部致死；朱日很滴丸中剂量：死亡1只，脑瘫致死；朱日很滴丸高剂量组：死亡1只，突发死亡，尸检发现肺部感染；普罗布考组：死亡2只，1只死于腹泻厌食，1只死亡原因不明。实验过程中，总存活率为88%，最终计入结果分析的兔数量为53只。

3.2各组摄食量和体质量变化结果 见表1。

表1兔的平均摄食量和体质量增加值

Tab.1 The average intake and the increasing weight of rabbits

组别0～8周平均摄食量/g·只-10～8周体质量增加值/kg·只-1溶媒对照组129.08±14.360.73±0.27模型组98.85±10.36**0.88±0.40朱日很滴丸低剂量组105.31±11.01**0.84±0.22朱日很滴丸中剂量组101.14±12.42**0.81±0.36朱日很滴丸高剂量组100.23±8.43**0.83±0.32普罗布考组99.97±9.03**0.87±0.34

注:与溶媒对照组比较**P<0.01。

由表1可知，与溶媒对照组比较，模型组、朱日很滴丸各剂量组和普罗布考组的摄食量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，但其体质量无明显变化，差异均无统计学意义(P>0.05)。

3.3各组血清中TG、LDL、HDL和CHOL含量的测定结果 见表2。由表2可知，第8周时，与溶媒对照组比较，模型组血脂成分几乎均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。第12周朱日很滴丸组给药结束后，与模型组比较，朱日很滴丸各剂量组血清中TG、LDL和CHOL的含量低于模型组，HDL的含量高于模型组，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2血清中TG,LDL,HDL和CHOL的含量

Tab.2 The content of TG，LDL,HDL and CHOL in serum

组别TG/mmol·L-1 0周 4周 8周 12周 LDL/mmol·L-1 0周 4周 8周 12周溶媒对照组0.76±0.150.80±0.240.70±0.170.77±0.160.17±0.090.21±0.070.23±0.070.18±0.09模型组0.88±0.180.94±0.112.46±1.21**3.60±1.21**0.21±0.143.75±4.33*11.41±4.04**21.18±6.49**朱日很滴丸低剂量组0.86±0.131.11±0.21*2.61±1.23** 3.32±0.53#0.18±0.083.45±3.33 9.89±3.03** 20.04±5.31# 朱日很滴丸中剂量组0.77±0.09 1.01±1.05* 2.50±1.66**3.19±2.31#0.15±0.053.05±4.02 10.02±6.83**19.87±10.86#朱日很滴丸高剂量组0.74±0.14 1.21±0.31*2.48±1.21**3.02±0.91#0.14±0.03 3.55±2.1210.09±4.56**18.44±5.33#普罗布考组0.81±0.071.02±0.13*2.54±1.42** 3.21±0.99# 0.16±0.053.25±1.1111.21±3.89**15.24±4.31## 组别HDL/mmol·L-1 0周 4周 8周 12周 CHOL/mmol·L-1 0周 4周 8周 12周溶媒对照组0.22±0.120.26±0.070.22±0.120.22±0.120.81±0.350.94±0.171.02±0.210.81±0.35模型组0.22±0.080.32±0.180.50±0.160.68±0.12*0.88±0.327.59±8.41*20.36±4.68**32.97±3.50**朱日很滴丸低剂量组0.29±0.070.28±0.090.56±0.120.72±0.21#0.86±0.335.89±3.21*15.66±4.52**31.88±3.41#朱日很滴丸中剂量组0.31±0.060.27±0.150.67±0.14*0.87±0.62#0.79±0.215.46±5.41*14.78±2.00**30.89±0.36#朱日很滴丸高剂量组0.24±0.020.29±0.080.54±0.130.90±0.33#0.80±0.215.58±1.32*16.75±3.88**29.87±4.12#普罗布考组0.26±0.040.31±0.030.51±0.180.71±0.28#0.79±0.126.21±2.48**19.32±5.01**25.12±3.21##

注:与溶媒对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较#P>0.05，##P<0.05。

3.4各组血清中炎症因子IL-6和TNF-α的含量测定结果 见表3。由表3可知，与溶媒对照组比较，模型组血清中IL-6和TNF-α的含量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，朱日很滴丸各剂量组血清中IL-6和TNF-α的含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

3.5各组血清中SOD、MDA和ox-LDL的含量测定结果 见表4。由表4可知，与溶媒对照组比较，模型组血清中MDA和ox-LDL的含量显著升高，SOD的含量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，朱日很滴丸各剂量组血清中MDA和ox-LDL的含量显著降低，SOD的含量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

3.6各组主动脉油红O染色及斑块覆盖率测定结果 见图1和图2。由图1和图2可知，与溶媒对照组比较，模型组的斑块覆盖率显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，朱日很滴丸各剂量组主动脉的斑块覆盖率均显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

表3血清中炎症因子IL-6和TNF-α的含量

Tab.3 The content of IL-6 and TNF-αin serum

组别IL-6/pg·mL-1TNF-α/pg·mL-1溶媒对照组400.25±95.47340.43±78.88模型组1 600.68±300.74**1 900.26±310.83**朱日很滴丸低剂量组1 200.11±147.12##1 483.76±212.13##朱日很滴丸中剂量组900.27±137.33##1 172.76±210.11##朱日很滴丸高剂量组700.24±128.32##863.34±119.56##普罗布考组720.89±127.25##660.87±109.89##

注:与溶媒对照组比较**P<0.01；与模型组比较##P<0.01。

表4血清中SOD、MDA和ox-LDL的含量

Tab.4 The contents of SOD，MDA and ox-LDL in serum

组别SOD/U·mL-1MDA/ng·mL-1ox-LDL/ng·mL-1溶媒对照组176.33±1.8270.15±11.314.27±0.80模型组70.8±18.53**205.53±31.35**6.67±1.91**朱日很滴丸低剂量组94.78±11.21#164.80±41.21#3.64±1.23##朱日很滴丸中剂量组118.8±11.51##144.40±20.98##2.87±0.98##朱日很滴丸高剂量组180.31±18.23##124.21±18.88##2.56±0.56##普罗布考组178.11±19.45##119.23±20.93##2.47±0.75##

注:与溶媒对照组比较**P<0.01；与模型组比较#P<0.05，##P<0.01。

图1主动脉油红O染色

A.溶媒对照组；B.模型组；C.普罗布考组；D.朱日很滴丸低剂量组；E.朱日很滴丸中剂量组；F.朱日很滴丸高剂量组。

Fig.1 The oil red staining of rabbit aorta

A.control group；B.model group；C.probucol group；D.low dose group of Zhurihen Dropping Pills；E.middle dose group of Zhurihen Dropping Pills；F.high dose group of Zhurihen Dropping Pills.

3.7各组兔主动脉的HE染色结果 见图3。由图3可知，与溶媒对照组比较，模型组平滑肌增生明显，细胞排列紊乱，内膜层泡沫细胞增多，管壁明显增厚，弹性纤维层结构不清，形成纤维增生性动脉粥样硬化斑块。与模型组比较，朱日很滴丸高剂量组细胞排列较整齐，平滑肌增生不明显，内膜层泡沫细胞较少，病变较轻，朱日很滴丸中、低剂量组相应病变均有减轻。

图2兔主动脉斑块覆盖率

A.溶媒对照组；B.模型组；C.普罗布考组；D.朱日很滴丸低剂量组；E.朱日很滴丸中剂量组；F.朱日很滴丸高剂量组。

注:与溶媒对照组比较**P<0.01；与模型组比较##P<0.01。

Fig.2 The plaque coverage rate of rabbit aorta

A.control group；B.model group；C.probucol group；D.low dose group of Zhurihen Dropping Pills；E.middle dose group of Zhurihen Dropping Pills；F.high dose group of Zhurihen Dropping Pills.

Note:**P<0.01 compared with vehicle control group；##P<0.01 compared with model group.

图3各组兔主动脉HE染色结果(×40)

A.溶媒对照组；B.模型组；C.普罗布考组；D.朱日很滴丸低剂量组；E.朱日很滴丸中剂量组；F.朱日很滴丸高剂量组。

Fig.3 The HE staining result of rabbit aorta(×40)

A.control group；B.model group；C.probucol group；D.low dose group of Zhurihen Dropping Pills；E.middle dose group of Zhurihen Dropping Pills；F.high dose group of Zhurihen Dropping Pills.

4 讨论

动脉粥样硬化主要发生在大动脉及中动脉，特别是冠状动脉、脑动脉等部位，并最终引发冠心病、心绞痛和心律失常等相关心血管疾病和脑血管疾病[9]。本实验采用油红O染色测定兔主动脉斑块覆盖率，结果显示，朱日很滴丸各剂量组能显著降低主动脉斑块覆盖率；主动脉的HE染色结果显示，朱日很滴丸各剂量组能显著减轻平滑肌增生，与模型组比较，细胞排列紊乱状况明显减轻，内膜层泡沫细胞明显减少，管壁增厚状况、弹性纤维层结构不清状况减轻。综上所述，蒙药朱日很滴丸能够发挥抗兔动脉粥样硬化的作用。

动脉粥样硬化的发病机制十分复杂，学者们曾提出了许多发病假说，如内皮损伤、氧化应激、感染、慢性炎症和血脂蛋白学说等[10]。有些发病理论如感染假说已被否定，有些学说如血脂蛋白、氧化、慢性炎症反应和血管平滑肌增殖学说则逐步得到公认[11-12]。从脂蛋白方面讲，随着对脂蛋白研究的深入，人们发现主要是低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与动脉粥样硬化的发生呈正相关，其机制是LDL可通过apoB100与细胞外基质相互作用沉积在动脉内膜下形成粥样斑块[13]；而高密度脂蛋白中的胆固醇(HDL-C)是将胆固醇逆向运输到肝脏处理的，可降低血中胆固醇水平，从而抵抗动脉粥样硬化。从炎症方面讲，动脉粥样硬化是一种慢性炎症疾病[14]，以内皮损伤为主要特征，可累及单核/巨噬细胞，多种炎性递质如IL-6和TNF-α等分泌增加[15]。IL-6是重要的趋化因子，能在病灶局部募集多种炎性介质，可加强巨噬细胞对低密度脂蛋白的摄入，促进泡沫细胞的形成；TNF-α是体内重要的炎性介质，能够直接造成细胞损伤，也能招募炎性细胞，诱导血管内皮细胞、血管平滑肌细胞的损伤，诱导单核细胞的迁移并与内皮细胞黏附以及泡沫细胞的形成有关，同时还能影响斑块的稳定性，深度参与动脉粥样硬化的形成和发展[16-17]。从氧化应激方面讲，近几年越来越多的证据表明超氧化物阴离子、羟自由基等活性氧的产生与抗氧化系统活性之间的失衡导致的氧化应激与动脉粥样硬化形成有关[18]。SOD是机体内主要的抗氧化酶和超氧自由基清除剂，其活性水平的高低代表了组织清除自由基的能力，MDA是细胞膜脂质过氧化的终产物，其表达水平高低是机体内的脂质过氧化程度的重要标志和动脉粥样硬化的病变指标[19]。LDL本身对动脉粥样硬化的形成并没有直接作用，过量的LDL会滞留于内皮下，经过细胞氧化修饰形成ox-LDL，而ox-LDL会加速泡沫细胞形成，加剧血管内皮细胞内氧化脂质的积累，促进炎性反应，导致AS纤维斑块增大[20]，促进血管平滑肌的增生等，是形成动脉粥样硬化的关键因素。

本实验主要从血脂蛋白、氧化应激、炎症和血管平滑肌增殖等方面综合考察了蒙药朱日很滴丸的抗动脉粥样硬化作用。实验结果表明，在动脉粥样硬化形成后给予一定时间的朱日很滴丸虽然能使TG、LDL和CHOL的含量小幅降低，HDL的含量小幅升高，但差异无统计学意义，说明朱日很滴丸抗动脉粥样硬化作用与降血脂作用关联度不大。蒙药朱日很滴丸能有效降低建模后家兔血清中IL-6、TNF-α、ox-LDL和MDA的含量，提高SOD的活性。结果表明，蒙药朱日很滴丸抗动脉粥样硬化作用与其抗炎、抗氧化应激密切相关，其更深层次及其他方面的机制有待进一步研究。