益母颗粒定性定量方法研究

李 鑫，张秀丽，赫 捷

(1.朝阳市药品检验检测所，朝阳 122000；2.朝阳市第二医院，朝阳 122000)

益母颗粒是由益母草、当归、川芎和木香制成，具有活血调经、行气止痛的功效，主治气滞血瘀所致的月经不调、痛经和产后瘀血腹痛等症，是常用的中成药，被收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第九册。该标准只有性状鉴别及检查项，为有效控制该品种的质量，增加了方中木香、当归、川芎和益母草的TLC法，建立了方中当归、川芎所含阿魏酸的含量测定方法,该方法可行，可提高益母颗粒的质量标准[1-10]。

1 仪器与试药

1.1仪器 岛津LC-2010A HT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；CPA225D型电子天平，BSA224S-CW型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；9860A型超声波清洗器(天津市科贝尔光电技术有限公司)。

1.2试药 益母颗粒(批号：170607，160116和160205，修正药业集团股份有限公司)；阿魏酸、盐酸水苏碱、当归、川芎和木香(批号分别为：110773-201313，110712-201614，120927-201516，120918-201612和120921-201309)，均由中国食品药品检定研究院提供；乙腈、甲醇均为色谱纯(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)；磷酸为分析纯(天津永大化学试剂有限公司)；水为超纯水。

2 定性分析

2.1益母草的鉴别

2.1.1供试品溶液 取益母颗粒粉末7 g，加15 mL沸水溶解，加稀盐酸使pH值调至1～2，通过阳离子交换树脂柱(732钠型，内径为2 cm，柱高为15 cm)，依次用水洗脱至洗脱液无色，弃去，再用250 mL氨溶液(2→13)作为洗脱液，收集于器皿中，蒸干得残渣，再用1 mL体积分数为70%的乙醇溶解，即得。

2.1.2阴性对照溶液 按照益母颗粒处方的制备方法，得到缺益母草的制剂，再按照2.1.1项下方法制备阴性对照溶液。

2.1.3盐酸水苏碱对照品溶液 取盐酸水苏碱2.13 mg，加体积分数为70%的乙醇1 mL，溶解，即得。

2.1.4薄层层析 在同一硅胶G薄层板上分别点供试品溶液、阴性对照溶液和对照品溶液各5 μL，用丙酮-无水乙醇-盐酸(10∶6∶1)溶液展开，取出，挥干展开剂，薄层板于105 ℃加热15 min使薄层板上残留盐酸完全挥尽，放冷，喷显色剂为稀碘化铋钾试液-三氯化铁试液(10∶1)的混合液至斑点清晰。供试品溶液与对照品溶液的薄层色谱显相同斑点，而阴性对照溶液的薄层色谱无相应斑点[11]，见图1A。

2.2当归、川芎的鉴别

2.2.1供试品溶液 取益母颗粒粉末14 g，用30 mL的乙醚回流30 min，取滤液挥干，用1 mL乙醇溶解，即得。

2.2.2阴性对照溶液 按照益母颗粒处方工艺，得到缺当归、川芎的制剂，再按照2.2.1项下方法制备，即得。

2.2.3对照品溶液 分别称取当归、川芎1 g，再按照2.2.1项下方法分别制成当归和川芎对照品溶液。

2.2.4薄层层析 在同一硅胶G薄层板上分别点供试品溶液和阴性对照溶液各5 μL，对照品溶液各2 μL，用正己烷-乙酸乙酯(4∶1)溶液展开，取出，挥干展开剂，在紫外光灯365 nm处观察。供试品溶液与当归、川芎对照品溶液的TLC色谱显相同斑点，而阴性对照溶液的TLC色谱无相应斑点[11-12]，见图1B。

2.3木香的鉴别

2.3.1供试品溶液 取益母颗粒粉末15 g，将30 mL甲醇作为溶剂，超声30 min，取出，滤液挥干至5 mL，即得。

2.3.2阴性对照溶液 按照益母颗粒处方工艺，得到缺木香的制剂，再按照2.3.1项下方法制备，即得。

2.3.3对照品溶液 称取木香0.5 g，用甲醇10 mL作为溶剂,超声30 min，滤液作为木香对照溶液。

2.3.4薄层层析 在同一硅胶G薄层板上分别点供试品溶液、阴性对照溶液和对照品溶液各5 μL，用环己烷-乙酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)上层液展开，取出，挥干展开剂，薄层板上喷10 mL·L-1香草醛硫酸溶液，加热，使薄层板上斑点清晰。供试品溶液与木香对照品溶液的TLC色谱显相同斑点，而阴性对照溶液的TLC色谱无相应斑点[13-14]，见图1C。

图1TLC图

A.益母草:1.阴性对照；2.盐酸水苏碱对照品；3.供试品。B.当归、川芎:1.阴性对照；2.当归对照药材；3.川芎对照药材；4供试品。C.木香:1.阴性对照；2.木香对照药材；3.供试品。

Fig.1 TLC chromatograms

A.Leonurusartemisia:1.negative control；2.stachydrine hydrochloride sample；3.sample.B.AngelicasinensisandLigusticumchuanxiongHort:1.negative control；2.Angelicasinensissample;3.LigusticumchuanxiongHort sample；4.sample.C.Radixaucklandiae:1.negative control；2.Radixaucklandiaesample；3.sample.

3 含量测定

3.1色谱条件与溶液的制备

3.1.1色谱条件 Thermo C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)(13∶87)；体积流量：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：316 nm。色谱图见图2。

图2益母颗粒的HPLC图

A.对照品；B.供试品；C.缺当归、川芎阴性样品；1.阿魏酸。

Fig.2 HPLC chromatograms of Yimu Granules

A.reference substance；B.sample；C.the sample withoutAngelicasinensisandLigusticumchuanxiongHort；1.ferulic acid.

3.1.2供试品溶液 取益母颗粒，研细，取细粉4 g，精密称定，移至50 mL碘量瓶中，精密加入体积分数为70%的甲醇20 mL，称定质量，超声30 min，取出，常温下再称定质量，并用体积分数为70%的甲醇补足减失的质量，摇匀，取续滤液作为供试品溶液。

3.1.3阿魏酸对照品溶液 精密称取阿魏酸适量，加体积分数为70%的甲醇，制成质量浓度为0.014 mg·mL-1的对照品溶液。

3.1.4阴性对照溶液 按照《卫生部药品标准》中药成方制剂第九册益母颗粒的处方工艺，制成缺当归和川芎药材的阴性对照样品，再按照3.1.2项下方法制备阴性对照溶液。

3.2系统适用性实验

3.2.1线性关系考察 精密称取阿魏酸对照品2.87 mg,置于100 mL量瓶中，加体积分数为70%的甲醇制成质量浓度为28.7 μg·mL-1的对照溶液，精密吸取对照溶液0.5，1，2，3，4和5 mL，置于10 mL量瓶中，按照3.1.1项下色谱条件进样，以质量浓度(x)对色谱峰面积(y)进行线性回归，回归方程为y=65 616x-8 751(r=0.999 5)，阿魏酸质量浓度在1.435～14.35 μg·mL-1范围内线性关系良好。

3.2.2供试品溶液稳定性实验 取供试品溶液(批号160205)，室温条件下放置，按照3.1.1项下色谱条件进样，每隔4 h进样1针(0～24 h)。结果供试品溶液中，阿魏酸峰面积的RSD值为0.3%，表明供试品溶液中阿魏酸在室温下放置24 h稳定。

3.2.3精密度实验 取3.1.3项下制备的阿魏酸对照品溶液，按照3.1.1项下色谱条件，连续进样6针。结果阿魏酸峰面积的RSD值为0.2%，表明分析所用仪器的精密性良好。

3.2.4重复性实验 取益母颗粒(批号160205),按照供试品溶液制备方法进行制备，制备6份，按照3.1.1项下色谱条件进样，每份供试品溶液进样2次。结果阿魏酸峰面积的RSD值为0.7%，表明该方法重复性良好。

3.2.5加样回收实验 精密称取益母颗粒(批号160205)细粉，每份2 g，共9份。分别加入低、中和高质量浓度阿魏酸对照品溶液1 mL，各3份，按照供试品溶液方法进行制备，按照3.1.1项下色谱条件进样，计算，结果见表1。

表1阿魏酸加样回收实验结果

Tab.1 Results of the ferulic acid recovery tests

称样量/g样品量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%均值/%RSD/%2.001 20.048 40.023 70.072 2100.4299.21.32.000 80.048 40.023 70.071 898.732.005 40.048 50.023 70.071 597.052.002 30.048 50.048 20.097 1100.832.001 80.048 40.048 20.096 299.172.000 60.048 40.048 20.096 7100.212.000 50.048 40.071 90.120 199.722.005 70.048 50.071 90.118 897.771.999 70.048 40.071 90.119 298.47

3.2.6样品测定 取3个批号的样品，按照3.1.2项下方法制备供试品溶液，再按照3.1.1项下色谱条件测定，结果见表2。

表2样品的含量测定结果

Tab.2 Results of sample content determination

(n=2)

4 讨论

4.1益母颗粒的质量控制 益母颗粒中的当归、川芎药材具有活血化瘀、行气调经止痛的功效，主治月经不调、经闭痛经等症，其质量直接影响益母颗粒的疗效，阿魏酸是当归、川芎中的主要有效成分，因此本实验采用测定阿魏酸的含量来控制当归和川芎的质量[15-16]。

4.2当归与川芎TLC色谱展开剂的选择 由于当归与川芎所含成分相似，因此本实验采用以当归对照药材与川芎对照药材同时作对照，对其进行定性鉴别，比较了正己烷-乙酸乙酯(2∶1)，(4∶1)和(7∶1)3种比例的展开剂，结果显示，乙酸乙酯比例越高，斑点展开越靠前，Rf值越大，实验证明采取4∶1比例分离效果好，Rf值适中，阴性无干扰，可用于当归与川芎的定性鉴别。

4.3流动相配比及提取方法的选择 HPLC法对阿魏酸进行测定时，对流动相配比进行考察，结果以乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)(13∶87)为流动相，阿魏酸与杂质峰的分离度较好，保留时间适宜。同时对提取方法进行考察，结果以体积分数为70%的甲醇作为提取溶剂，超声处理30 min提取效果佳，杂质峰较少[17]。