生长素极性输出载体PIN的研究进展*

潘建伟， 张晨燕， 周哉材

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004；2.兰州大学 生命科学学院，甘肃 兰州 730000)

1928年，荷兰科学家Went[1]首次描述了生长素(auxin)及其在植物生长发育中的作用.随后，美国科学家Thimann成功分离和鉴定出生长素主要成分吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA).生长素几乎参与调控植物每一个生长发育过程[2-3]，其对植物生长发育的调控作用主要取决于3个复杂的过程:生长素代谢、生长素运输和生长素信号转导.生长素的运输分为2种途径：被动运输(不消耗能量，不固定运输方向)与极性运输(消耗能量，具有运输方向).植物发育过程很大程度上是由生长素梯度(auxin gradient)分布引起，而这种梯度分布正是由生长素极性运输所维持的[4].

生长素的极性运输由3类转运蛋白介导完成[5]，包括生长素输入载体AUX1/LAX(auxin 1/like-auxin)[6-7]、生长素输出载体PIN(pin-formed)[8-9]和ABCB/PGP(ATP-binding cassette B subfamily/P-glycoprotein)转运体[10].其中，PIN蛋白的质膜极性分布模式在调节生长素不对称分布方面起着重要作用，是决定生长素极性运输方向的关键调控因子[11-12].拟南芥(Arabidopsisthaliana)基因组编码8个PIN蛋白(PIN1—PIN8)均为跨膜蛋白.根据亲水区的长短，将PIN蛋白分为2类：长PIN蛋白PIN1—PIN4及PIN7；短PIN蛋白PIN5，PIN6及PIN8[13].鉴于PIN蛋白的结构预测、功能验证及表达模式已经有比较全面的综述，本文在这些方面就不再赘述.PIN极性定位和输出活性受多种机制调控：磷酸化/去磷酸化、极性锚定、胞内运输等，本文着重介绍最近几年有关PIN质膜极性定位和输出活性的分子调控机理研究的最新进展.

1 PIN质膜极性定位与运输活性的磷酸化调控机理

PIN蛋白的表达模式和亚细胞定位暗示转录翻译后的修饰机制对PIN的生物学功能发挥重要作用[14].在PIN的修饰机制中，磷酸化机制一直被认为是调控PIN蛋白极性定位和运输活性的重要机制之一.目前已知3类蛋白激酶家族涉及PIN蛋白磷酸化，包括AGC激酶(protein kinase A,G和C)、促分裂素原活化激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和钙调蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase，CDPK)[9].植物通过去磷酸化机制拮抗PIN的磷酸化作用(见图1)，表明PIN蛋白的磷酸化是一个可逆过程.

1.1 AGCVⅢ激酶调控PIN介导的生长素极性运输

拟南芥基因组编码39个AGC激酶，分为5个亚族：AGCVⅠ,AGCVⅡ,AGCVⅢ,PDK1及其他AGC基因[15].其中AGCVⅢ为最大的亚族，包含23个AGC激酶，细分为AGC1,AGC2,AGC3和AGC4 4类[16].

PIDs,D6PKs,CRK5和MKK7-MPK3/4等磷酸激酶使PIN蛋白磷酸化，调控其极性定位和活性；PP2A磷酸化酶拮抗磷酸化作用；MAB4和Pin1AT协同PID功能在不同侧壁发挥功能.带字母“P”的圆圈代表磷酸化.

图1 磷酸化/去磷酸化调控PIN极性定位与活性[9，14]

PID(pinoid)蛋白和PID2,WAG1,WAG2同属于AGCVⅢ激酶AGC3类[17]，统称为PIDs，它们之间功能冗余，通过调控PIN的亚细胞定位来影响子叶的发育、顶勾的打开、根分生区的大小、果荚的形成等生物学过程[18-20].已有大量的实验证据表明，非极性定位的PIDs通过直接磷酸化PIN亲水区3个高度保守的丝氨酸位点(S1—S3)(见图2)调控PIN从细胞基部定位到细胞顶部(见图1)，从而影响生长素的分布[21-25].然而，磷酸化位点特异性抗体检测表明，过表达PID后，质膜上、下两端的PIN1 S1—S3位点均被磷酸化[26]，暗示PIN存在更复杂的PIDs磷酸化调控机理.

空心圆为PIDs和D6PKs激酶共同磷酸化位点，PIDs磷酸化偏向位点用实线圆标记，D6PKs磷酸化偏向位点用虚线圆标记；实心圆标记MKK7-MPK3/4级联反应磷酸化位点；正方形标记AP-2连接蛋白分拣位点；三角形标记Pin1AT异构酶改变PIN构象的位点.

图2 拟南芥PIN的功能位点示意图[14]

D6PKs(D6 protein kinases)亚家族由D6PK,D6PKL1(D6PK-like 1),D6PKL2,D6PKL3组成，属于AGCVⅢ的AGC1类蛋白激酶[27]，在下胚轴的向光性、背地性及侧根和芽的分化过程中调控生长素的运输[28-31].D6PKs在大部分细胞中极性分布，主要在根细胞中表达，与基部定位的PIN1,PIN2和PIN4相似[32].利用遗传材料或药剂处理使D6PKs功能缺失，都能降低PIN蛋白的磷酸化及生长素极性运输速率，暗示D6PKs调控PIN介导的生长素极性输出活性[25-26,29,32].D6PKs磷酸化PIN的位点除了S1—S3外，还包括另外2个丝氨酸位点S4和S5[25](见图2).S4和S5在PIN3,PIN4及PIN7中保守，但在PIN1和 PIN2中发生突变.D6PKs过表达并不能导致PIN蛋白极性的改变[25]，它与PIDs磷酸化的不同功能被归因于不同的磷酸化位点偏好[25,33](见图2).而最新研究发现,根尖细胞基部定位的PIN1 S1—S4位点均被磷酸化且对BFA敏感[26]，表明PIN基部定位的磷酸化与D6PKs磷酸化位点偏好无关.

其他AGCVⅢ蛋白激酶如AGC1—3和AGC1—12同样能够通过磷酸化PIN蛋白参与调控下胚轴的向光性，但其具体机理尚未清楚[28].此外，AGCVⅢ家族一些成员被证明能够在体外磷酸化PIN1，如AGC1—5和KIPK，这与在D6PKs和PIDs缺失突变体中仍能观察到PIN1 S1—S4位点磷酸化的情况相符[26-28].另外，PIDs也能够激活PIN的生长素输出活性[25]，可见AGCVⅢ磷酸激酶在多个方面调控PIN的功能.

1.2 CDPK调控PIN在质膜上的分布

CPKs/CDPKs是一种Ca2+感受器，参与Ca2+信号途径来响应生理反应[34].体外实验证明马铃薯CDPK1(StCDPK1)能够磷酸化StPIN4[35]，暗示CDPK可能通过介导PIN的磷酸化从而影响植物的生长发育.CRK(CDPK-related kinase)是Ca2+信号转导的主要调控因子，是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，拟南芥中共有8个CRK成员，大部分CRK通过调控生长素运输和信号转导来影响植物生长发育[34].2018年，Baba等[36]通过T-DNA敲除所有CRK基因发现CRK调控PIN2的丰度和定位，表明PIN受CRK蛋白激酶的磷酸化调控，进而参与植物生长发育.深入研究发现，AtCRK5在根表皮和皮层细胞的外侧质膜上呈明显的U形分布，在体外能够直接磷酸化PIN2蛋白，而体内实验证明AtCRK5通过抑制PIN2的内吞和促进PIN2的再循环来调控根的向地性反应和生长素极性运输[37](见图1)，但其具体磷酸化位点仍然未知.

1.3 MAPK调控PIN极性

拟南芥基因组编码20个MAPK和10个MAPK激酶(MAPK kinase，MKK)，MKK-MAPK信号级联通路参与调控很多植物发育进程[38].MKK7正向调控生长素运输[39].定点突变PIN1丝氨酸位点S337使其持续磷酸化，导致PIN1在下胚轴及茎细胞中去极化，表现出和bud1(MKK7过表达突变体)突变体相似表型，证明MKK7下游蛋白激酶MAPK3或MAPK6通过磷酸化PIN1 S337位点介导PIN的极性定位，进而调控植物生长发育[38].另外，在拟南芥胚胎中突变PIN1 S337及苏氨酸位点T340导致PIN1失去顶端极性定位，在根表皮细胞中以PIN2启动子表达磷酸化位点突变的PIN1蛋白能够挽救pin2突变体表型[40]，推测MKK7-MAPK3/6蛋白激酶级联介导S337和T340位点磷酸化导致PIN从细胞基部去极化.PIN1 S337和T340在PIN蛋白中并不保守，暗示不同的长PIN蛋白具有不同的极性定位调控机制.最近研究发现，PIN1的苏氨酸残基T227,T248和T286能够被MAPK4和MAPK6磷酸化，这3个苏氨酸是高度保守基序“TPRXS(N/S)”的一部分，这些基序也包含S1—S3位点(见图2)，暗示AGCVⅢ蛋白激酶和MAPK蛋白激酶通过磷酸化PIN的丝氨酸和苏氨酸位点来介导PIN的极性[41].然而，AGCVⅢ蛋白激酶和MAPK蛋白激酶功能缺失突变体却具有不同表型.因此，这些蛋白与PIN极性、生长素极性运输和植物生长之间的调控关系仍有待于进一步研究.

1.4 去磷酸化酶拮抗调控PIN蛋白的磷酸化

PIN通过可逆的磷酸化机制调控自身动态极性定位[42-43].最先发现PIN去磷酸化相关蛋白为PP2AA1(A subunit of protein phosphatase 2A)[44]，下调PP2AA1与其功能冗余基因(包括PP2AA2—PP2AA3)造成PIN由质膜基部向顶部定位[45].PP2AA(包括PP2AA1—PP2AA3)、SAL(SAPS domain-like)和FYPP1/3(phytochrome-associated serine/threonine protein phosphatase 1 and 3)分别作为调控亚基和催化亚基形成PP6(protein phosphatase 6，PP2As(protein phosphatase 2A)类似物)全酶复合物，共同调控PIN去磷酸化[46].PP2As其他亚基也被证明能够直接使PIN1去磷酸化，如TOPP4(type-one protein phosphatase 4)[47].此外，部分亚基(PP2A-C3/4)通过调控PIN的极性，建立生长素浓度梯度的研究也有报道[48].

1.5 PIN蛋白磷酸化调控途径中的其他参与蛋白

之前的观点一直认为PIN的极性取决于S1—S3位点是否被PIDs磷酸化，即质膜基部定位的PIN被磷酸化后定位在质膜顶部，直到去磷酸化为止，这一观点得到一系列实验的支持[18,22-23,45-47,49-50].然而最新证据表明，不论是质膜顶端还是底端的PIN都显示S1—S3位点被磷酸化，但对BFA敏感性不同，暗示需要建立一个更复杂的极性定位模型来解释PIN磷酸化调控.

已有文献报道，MAB4/ENP/NPY1(macchi-bou 4/enhancer of pinoid/naked pins in yuc mutants 1)能够和PID互作，影响PIN1在胚胎、子叶原基的极性定位[51-53].突变MAB4的所有同源基因MEL(MEL1，MEL2，MEL3)影响了组织的生长、根的向地性，以及PIN2的定位、丰度和内吞速率(见图1).MEL蛋白在胚胎和根细胞中极性定位，定位区域和PIN蛋白基本一致[54-55]，暗示MAB4/MEL可能是极性因子或者帮助非极性PIDs蛋白调控PIN极性定位的调控因子.

下调顺反式脯氨酸异构酶Pin1AT(cis/transprolyl isomerase)抑制PID过表达株系的表型，暗示Pin1AT和PID功能拮抗，使PIN1去磷酸化[56].顺反式脯氨酸异构酶通过催化T或S前的脯氨酸顺反式异构调控蛋白功能.Pin1AT能够催化PIN1 S337附近的脯氨酸异构，另外，PIN1苏氨酸位点 T227,T248和T286最近被证明是MPK4或MPK6的靶位点[38,41,56]，这些位点都与脯氨酸残基相邻,构成“TPRXS(N/S)”基序(见图2)，暗示PID决定的PIN1极性定位依赖于PinAT和MKK-MAPK级联反应.但Pin1AT对PIN1影响具有特异性，可能存在几种不同的异构酶协同磷酸化机制调控不同PIN的极性定位[56].

2 PIN极性维持的锚定机制

PIN蛋白的质膜极性定位维持是生长素极性输出的重要调控机制之一,与无极性的质膜蛋白相比，PIN的不同之处在于PIN在质膜上的横向扩散受到限制.高分辨率显微镜分析显示，PIN1和PIN2在质膜极性定位的区域上也存在不均匀分布，大部分蛋白成簇聚合(见图3)，形成直径为100～200 nm的簇状聚合体(clusters)，这些簇状聚合体由鞘脂、固醇和PIN蛋白构成，受固醇结合剂(filipin)干扰，削弱簇化结构[57].另外，一些极性定位在质膜基部或顶部的磷脂酰肌醇也会影响PIN蛋白的极性分布和PIDs的质膜定位[58-59].

簇状聚合体：簇状结构；质膜与细胞壁之间棒状结构为郝式丝；CME：网格蛋白介导的内吞； GNOM介导再循环及分泌途径.

图3 PIN极性定位维持机制[9,14]

此外，植物细胞壁也被证明和PIN在极性区域锚定有关.通过化学消化或遗传干扰抑制细胞壁生成会导致PIN1的极性迅速消失；质壁分离的PIN2蛋白会加快横向扩散速率[60].进一步的研究发现，植物细胞壁通过郝式丝(Hechtian strands)与质膜连结，抑制质膜蛋白的横向扩散[61](见图3).这些研究结果表明，细胞壁参与调控PIN极性定位的维持.然而，极性区域PIN蛋白成簇状分布的成因及细胞壁如何分拣锚定蛋白的机制仍需进一步研究.

3 胞内转运维持PIN的极性定位

PIN簇状结构及细胞壁锚定都只能减少极性区域原有PIN的横向流动，而质膜的流动性和外界环境刺激均会影响离散分布(非簇状)的PIN发生极性变化[57].越来越多的细胞证据表明，胞内运输，即不断将错误定位的PIN蛋白内吞(endocytosis)与再循环(recycling)到质膜的极性区域，是维持PIN极性定位的重要原因之一.

3.1 网格蛋白介导PIN内吞

PIN的胞内运输比其质膜侧向运动更高效快速地改变PIN的定位[57].目前研究显示，PIN通过网格蛋白介导的内吞(clathrin-mediated endocytosis，CME)途径从质膜进入胞内[62-66].

网格蛋白需要接头蛋白AP-2(adaptor protein-2)及其他辅助蛋白(AP180和epsin等)的协同招募才能定位于质膜上，已知AP-2和货物蛋白结合后发生构象变化，暴露与网格蛋白结合的结构域，招募网格蛋白到需要内吞的质膜区域[67].AUXIN-LIKE1/2作为一种新发现的CME调控因子，在AP-2和货物蛋白结合之后抑制网格蛋白的招募，从而阻碍幼苗的生长[68].利用BFA处理或Dendra标记AUXIN-LIKE1/2过表达株系的PIN2，发现网格蛋白介导PIN2的内吞明显受到抑制[68](见图3).已知AP-2通过“YxxΦ”基序拣选质膜蛋白内吞，突变PIN2蛋白的酪氨酸(PIN2,Y505)明显促进PIN横向扩散[57,67].然而另一研究发现，定点突变苯丙氨酸基序(PIN1,F165)亦能影响AP蛋白调控PIN1蛋白的转运及定位[69](见图2)，暗示网格蛋白介导PIN内吞的复杂性.

3.2 PIN的再循环途径

BFA处理实验表明，定位在TGN/EE(trans-Golgi network/early endosome)的ARF-GEF GNOM(ADP-ribosylation factor guanine-nucleotide exchange factors，GNOM)能够调控PIN蛋白从内体(endosomes) 再循环到质膜基部[21,70].PIN1磷酸化抗体检测BFA处理后的GNM696L和GNWT，发现GNWT中磷酸化的PIN1明显少于GNM696L，暗示GNOM通过维持PIN1的磷酸化从而维持PIN1的极性[26].然而，2014年的研究显示，GNOM定位于高尔基(golgi apparatus)，BFA处理导致GNOM错误定位到TGN/EE上[71].对GNOM亚细胞定位认识的改变，支持了GNOM是在早期分泌途径中调控PIN极性的观点[72].利用光转换荧光蛋白Dendra2分析发现，BFA小体中富集的都是新合成的PIN2，暗示BFA抑制GNOM介导的分泌途径，而不是PIN的回收途径[73].之前GNOM在胞内运输的功能分析都是建立在BFA药理分析的基础上，但BFA在细胞学上的功能还存疑.目前已确定GNOM在PIN极性定位中起着关键性作用，但GNOM的精确功能仍没有定论.

利用BFA药物分析手段还发现ARF GTPase机制中其他调控因子，例如GNOM-LIKE1[74-75]，BEN1/MIN7[76]，VAN3[77]及最近报道的14-3-3 epsilon[78].拟南芥中存在13个14-3-3蛋白，根据是否具有高度保守的生物功能分为2类，14-3-3 epsilon属于保守的14-3-3 epsilon组，一共有5个蛋白.下调14-3-3epsilon基因(epsilon，mu，omicron)导致生长素分布模式发生改变，产生生长素极性运输缺陷相关的表型；另外，PIN1和PIN2的组织表达也发生变化，极性减弱，再循环途径受到干扰[78].

4 展 望

已知生长素极性运输在植物配子体发生、胚胎与果实发育、侧生器官发生、向性生长和逆境响应中均具有重要的生物学功能，是植物生长发育的重要调控机制之一.自从拟南芥PIN基因克隆以来，经过20年的研究，人们对PIN的表达调控、极性定位和运输机制及其生物学功能已有深入的了解.然而，PIN蛋白如何介导生长素极性输出的分子作用机制至今仍没有被彻底弄清楚.因此，在PIN介导生长素极性运输研究领域中亟待解决以下几个重要科学问题：1)解析PIN蛋白的晶体结构，这是PIN介导生长素极性运输的核心科学问题或瓶颈问题，也是最关键的生化证据；2)PIN极性建立与维持的分子调控机制，这是剖析细胞水平生长素极性流向的重要机制；3)PIN质膜内吞与胞内运输的分子机制，既是PIN极性建立与维持机制的重要研究内容之一，也是PIN介导生长素极性输出的重要调控机制之一.坚信随着这些科学问题的解决，PIN介导的生长素极性输出的分子机制会更加清晰.