南高丛蓝莓VcMET1基因分离及在果实发育中的表达分析*

邵 楠， 陈曼曼， 朱雨飞， 陈文荣， 宗 宇，李永强， 廖芳蕾， 郭卫东， 杨 莉

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

表观遗传是指在植物体发育和细胞增殖过程中，基因序列不发生改变，而基因表达发生可遗传的改变，主要涉及DNA甲基化、组蛋白共价修饰、染色质重塑、基因沉默与RNA编辑等调控机制[1-4].DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因组常见的共价修饰形式之一.DNA甲基转移酶将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基转移到特定DNA序列的碱基上，主要以5-甲基胞嘧啶(5mC)形式发生于对称序列CG,CHG(H=A,C或T)，以及非对称序列CHH[3-5].植物中至少有4种胞嘧啶甲基转移酶，包括维持DNA甲基转移酶(methyltransferases，METs)家族、结构域重组甲基化酶(domains rearranged methyltransferases，DRMs)、染色质甲基化酶(chromomethylases，CMTs)与DNA甲基转移酶2(DNA methyltransferases,Dnmt 2)家族[3,6-7].越来越多的研究表明，DNA甲基化在植物生长发育及应对环境胁迫中发挥重要作用，可影响植物株高、花型、果实着色、抗病性、生育期及其与环境的互作等[2-4,8].

蓝莓为杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vacciniumspp.)植物，多年生落叶或常绿灌木或小灌木[9].蓝莓果实因富含花青素、多种人体必需氨基酸及硒等营养成分，被誉为“21世纪功能性保健浆果”.与其他水果相比，蓝莓果实单果重轻(约1.0 g)、产量低(亩产约1 000 kg)、不耐贮运，因此,培育或筛选大果型、高产、抗病虫害、耐贮运且便于机械操作的蓝莓果实是果树育种者的主要目标[10-11].目前国内外对蓝莓果实的研究主要集中在品质、贮藏加工、花青苷合成及调控机制等方面[12-17]，鲜有DNA甲基化与蓝莓果实发育的相关研究.本实验以果实较大的蓝莓果实品种‘奥尼尔’(O′Neal)与小果品种‘蓝雨’(Bluerain)为研究材料，分离DNA甲基化基因MET1 cDNA序列，研究其果实在不同发育时期的表达规律，为进一步探讨这些基因在蓝莓果实发育进程中的生物学功能与分子调控机制奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用材料为定植于浙江师范大学生物园6年生的蓝莓(V.corymbosum)‘奥尼尔’与‘蓝雨’果实，将铃铛花期(去除花瓣，仅保留花托与子房)标记为S0期，取果实生长发育曲线特定时期样品，每个时期采样20～50个果实.以‘奥尼尔’为例，果实取样时状态参见图1.S5期及以后的果实取回后，迅速用手术刀切成小块.处理后的样品经液氮速冻后，冻存于-80 ℃备用.

图1 ‘奥尼尔’蓝莓果实发育过程中各时期取样点

1.2 总RNA的提取及cDNA一链合成

参照张彦苹等[18]建立的改良SDS法提取各时期混合样品总RNA，DNase I去除残留的基因组DNA.RNA经凝胶电泳及紫外分光光度计法检测质量与浓度后，取1 μg参照反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent kit with gDNA Eraser(TakaRa)说明书合成cDNA一链，保存于-20 ℃备用.

1.3 VcMET1基因cDNA分离及序列分析

根据IGB(integrated genome browser 8.4.4)软件发布的蓝莓序列(VcMET1：cuff.5305.1)设计引物(见表1)，以‘奥尼尔’S1期cDNA为模板，应用PCR法分别分离VcMET1基因编码区cDNA，连接至T载体后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，每个基因重复3次扩增与测序.所用引物由擎科生物技术(杭州)有限公司(Tsingke)合成.

利用NCBI 网站生物学软件BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行cDNA及氨基酸序列同源性比对；在线软件Translate(http://web.expasy.org/translate/)推导其氨基酸序列；在线软件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)预测编码蛋白的分子量、理论等电点、蛋白质不稳定系数等；MEGA 6.0软件(应用neighbor-joining法，模式为p-distance,gap空位为Complete deletion，校验参数设置为Bootstrap=1 000)构建氨基酸序列进化树.

表1 蓝莓DNA甲基化相关基因VcMET1基因分离及表达引物

1.4 VcMET1基因在果实发育中的表达分析

根据分离得到的cDNAs序列，应用Primer 3 Input (version 0.4.0，http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)在线软件设计qPCR定量分析引物(见表1)，以VcGAPDH基因为内参[14]，使用StepOne PlusTMqPCR仪，按照SYBR®PremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa，大连)配制反应体系，采用二步法检测VcMET1基因在蓝莓果实不同发育时期的相对表达水平.每个样品重复3～6次，共3个生物学重复.qPCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性3 s，60 ℃退火及延伸45 s，40次循环，每个循环第2步最后5 s采集荧光信号.反应结束后进行熔解曲线分析及琼脂糖凝胶电泳鉴定产物特异性.采用2-ΔΔCT法[19]分析qPCR数据，应用Origin 7.0软件对数据作图.

2 结果与分析

2.1 VcMET1基因的分离与序列生物信息学分析

利用已经公布的蓝莓序列，应用PCR扩增的方法，从‘奥尼尔’S3期果实中成功分离出VcMET1基因(GenBank登录号：KY964443.1)编码区cDNA序列.测序序列表明该基因的开放阅读框包含4 647 bp，编码1 548个氨基酸残基，分子量为174.76 kDa，等电点5.70，不稳定系数为43.08，GRAVY(总平均亲水性)值为-0.516.

分析推导的氨基酸序列发现，VcMET1包含2个N端调控区的复制叉作用位点DNMT1-RFD结构域，2个参与DNA甲基化、复制与转录调控的BAH(Bromo adjacent homology domain)结构域及1个胞嘧啶甲基转移酶(Dcm)结构域.进一步将分离的VcMET1序列与其他植物相关蛋白进行蛋白聚类分析发现，VcMET1与香瓜类似的MET1B蛋白(XP_008464733)有70%的相似性，并介于一年生草本与木本植物之间(见图2)，表明VcMET1蛋白具有一定的保守性，但在进化过程中也存在物种差异性.

2.2 VcMET1基因在果实发育进程中的表达分析

应用qPCR技术，分析了VcMET1基因在蓝莓果实发育进程中的相对表达水平.如图3所示，‘奥尼尔’与‘蓝雨’果实发育进程中VcMET1基因呈先上升再下降趋势，并在果实发育早期(S0～S4期)的表达丰度显著高于中后期的果实.‘奥尼尔’在果实发育早期VcMET1基因表达丰度相对较低，在果实快速生长阶段(S3～S4期)表达快速上升，极显著高于同时期‘蓝雨’果实，并在果实后期及成熟期(S6～S7期)表达水平下降至发育初期的1/3～1/2.‘蓝雨’果实发育初期(S0～S1期)VcMET1基因表达显著高于‘奥尼尔’，分别是‘奥尼尔’的2.26倍与6.08倍，随后表达丰度急剧下降，直至无法检测(S4～S7期).

图2 蓝莓VcMET1与其他植物相应蛋白系统进化树

图3 蓝莓果实发育进程中VcMET1基因相对表达分析

3 讨论

DNA甲基化是重要的表观遗传现象，对于维持植物正常生长发育必不可少，参与基因表达的调控，如复制、转录、DNA修复、细胞分化等[1-4，8].植物中DNA甲基化程度主要受体内甲基化酶与去甲基化酶的调控，DNA甲基化水平过高或过低，均会导致植物生长发育异常或表型异常.在已知的3类典型DNA甲基转移酶中，MET1主要在重复及单拷贝DNA序列中维持CG基序中胞嘧啶的甲基化，与哺乳动物Dnmt1功能类似.目前，已知拟南芥中存在4条AtMET1(MET1，MET2a，MET2b与MET3)，甜橙[20]与番茄[8]中也分别分离到一条MET1序列.本实验仅从蓝莓中分离出1条VcMET1基因序列，可能原因在于蓝莓基因组及转录组数据库不完善，还存在其他的VcMET1同源基因.

与其他植物相比，蓝莓DNA甲基化酶基因VcMET1推导的氨基酸序列包含植物中相对保守的结构域，序列相似度也较高，表明DNA甲基化酶基因VcMET1在植物进化过程中相对保守.除催化甲基转移至胞嘧啶的MTase结构域外，VcMET1中还存在其他蛋白识别、结合与调控的结构域BAH和DNMT1-RFD等，与前人报道中DNA甲基化酶并非单独作用，而与其他蛋白质以蛋白复合体的形式催化特定位点的胞嘧啶甲基化的结论吻合[3-4，21].

在植物生长发育过程中，特别是果实的发育进程中DNA甲基化水平呈动态变化[3-4]，推测DNA甲基化酶在相应时期快速合成或降解，以维持其在相应阶段的动态变化趋势.Hadfield等[22]发现番茄果实在成熟过程中DNA甲基化程度下降，与DNA甲基化基因的表达降低相偶联.进一步研究发现，随着果实的成熟，DNA甲基化水平在果皮中降低，在腔室中变化不显著；SlMET1在果实发育进程中呈下降趋势，在幼果中表达丰度极高.CsMET1在甜橙‘暗柳’与‘红暗柳’果肉中随果实成熟表达上调，与果实后期甲基化水平上升相符[20].本研究发现，蓝莓VcMET1在果实发育早中期表达丰度较高，后期表达迅速下降，甚至无法检测.除了基因表达模式不同，不同植物中DNA甲基化的程度与分布也存在较大差异[3，23-24]，表明DNA甲基化在结构复杂的非模式植物中可能具有更为重要的作用，并且DNA的甲基化与去甲基化系统协同作用，共同决定基因组中DNA甲基化水平.

现已证明，DNA甲基化在植物生长发育调控中发挥着极其重要的作用，但大多数研究停留于拟南芥、水稻与番茄等模式植物.其他植物,尤其是对果树果实生长发育中的相关研究报道较少，开展这方面的研究为深入解析DNA甲基化对果实发育的调控作用奠定基础.本研究从蓝莓中分离出DNA甲基化相关基因VcMET1，以及在果实发育进程中的表达模式，而有关其他DNA甲基化与去甲基化相关基因的信息，以及蓝莓果实中DNA甲基化的程度与分布，如何作用于果实生长发育，仍有待于深入研究.