亚麻多肽制备及其抗氧化活性分析

吴峰，王常青，石亚伟，*

（1.山西大学生物技术研究所，山西太原030006；2.山西大学生命科学学院，山西太原030006）

亚麻（linum usitatissimum linn）也称胡麻，是我国五大油料作物之一，我国油用亚麻（胡麻）主要分布在华北、西北等地，主产区是内蒙古、甘肃、宁夏、河北、山西、陕西和新疆，西南地区的云南等地也有种植[1-4]。亚麻饼粕属于亚麻籽榨油后的下脚料，其粗蛋白的含量高达43%左右，亚麻籽粕含有丰富的α-亚麻酸、木质素以及蛋白类等物质[5]，同时也含有丰富的维生素A、维生素B、维生素E等维生素，具有很高的营养价值，可作为油料作物配合开发新营养主食品种的原料，但是亚麻饼粕通常作为动物饲料或肥料使用，存在着巨大的浪费。

植物蛋白质经蛋白酶部分水解后，可获得具有生物活性的多肽诸如抗氧化作用、降血脂、抗肿瘤、抗高血压、活化细胞免疫机能等多肽[6-9]，是现代食品和医药领域最热门的研究方向，也是提升植物蛋白利用价值的主要方向。目前对于大豆、花生等原料多肽的制备工艺和功能性进行较多的研究，如周婷婷等[10]筛选制备抗氧化大豆多肽的水解酶及水解条件，从而得到高效的抗氧化大豆多肽制品；刘英丽等[11]研究确定了酶解花生粕制备抗氧化肽的最佳工艺参数。目前国内对于亚麻的研究主要集中在亚麻油脂的开发利用，而对亚麻蛋白质的研究关注较少，特别是对脱脂亚麻粉中蛋白肽的制备研究甚少。亚麻籽蛋白也是一种优良的植物蛋白[12]，（以亚麻饼粕为原料，通过对不同蛋白酶的酶解效率比较，建立3.350酸性蛋白酶解亚麻籽粕制备多肽的实验室工艺，并对制备的亚麻多肽的还原能力和清除O2-·和DPPH·的能力，进行测定，显示其具有较好的体外抗氧化活性，为后续亚麻多肽饮料和功能性食品的开发提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

胃蛋白酶（30U/mg）、胰蛋白酶（165 U/mg）：Solarbio公司；木瓜蛋白酶（10万U/g）、菠萝蛋白酶（80万U/g）、537酸性蛋白酶（2.05万U/g）：广西庞博生物工程有限公司；3.350黑曲酸性蛋白酶（35 000 U/g）：天津市诺奥科技发展有限公司；其它试剂均为国产分析纯；亚麻籽粕：山西省农业科学院提供；苦肽（MLIPPFFVI）：华大基因合成；亚麻胰蛋白酶抑制剂（LUTI）为山西大学生物技术研究所制备。

1.2 仪器与设备

QT2000自动液相色谱分离纯化层析仪：上海琪特分析仪器有限公司；Lambda 35双光束紫外可见光光度计：珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司；D-37520高速冷冻离心机：美国Thermo Fisher Scientific公司；FD8-4T冷冻干燥仪：GOLD-SIM公司。

1.3 多肽含量和多肽得率的测定

亚麻多肽含量参照QB/T2879-2007《海洋鱼低聚肽粉测定》[13]中的三氯乙酸沉淀法测定，其中总氮采用半微量凯氏定氮法，氨基酸态氮按照GB 5009.235-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中的甲醛滴定法测定。

多肽得率/%＝（离心上清液中总氮量-离心上清液中氨基酸态氮含量）/样品中总氮量×100

1.4 亚麻蛋白粉的制备

取一定量烘干的亚麻饼粕粉按1∶30（g/mL）加入蒸馏水，用1 mol/L的氢氧化钠调pH值到9.5～10.0，在60℃的水浴中保温搅拌3 h，然后离心取上清液。沉淀物进行二次提取、离心。两次上清液合并后，用稀盐酸调pH值到4.0～4.5沉淀蛋白，并水洗两次；水洗蛋白用1 mol/L氢氧化钠调pH值到7.0，然后冷冻干燥，得到成品亚麻蛋白粉。

1.5 水解多肽蛋白酶的筛选

准确称取亚麻蛋白粉，按1∶20（g/mL）加入蒸馏水，按每克蛋白6 000 U的酶剂量分别加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、537酸性蛋白酶和3.350酸性蛋白酶，在各种蛋白酶的适宜条件下水解2 h，沸水浴30 min灭酶活，离心分离（8 000 r/min，10 min），取上清液，测定多肽含量。以多肽得率为指标，筛选出最佳蛋白酶。

1.6 亚麻多肽制备工艺条件的优化

1.6.1 单因素试验

以亚麻多肽得率为评价指标，用筛选出的酶解多肽得率最高的蛋白酶做进一步的单因素试验。按料液比 1 ∶20（g/mL），考察该酶在不同酶解温度（30、40、50、60、70）、酶解 pH 值（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0）、加酶量（3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 U/g）和酶解时间（1、2、3、4、5 h）4个单因素条件下对多肽得率的影响。

1.6.2 正交试验

以单因素试验的试验结果为基础，在酶解温度、酶解pH值、加酶量和酶解时间,四因素三水平下做正交试验，确定多肽得率最佳的酶解条件。正交试验方案L9（34），见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

1.7 抗氧化活性研究

还原能力的测定方法参照文献[14]；DPPH·清除率的测定方法参照文献 [15-17]；超氧阴离子自由基（O2-·）的清除率的测定方法参照文献[18-19]。

1.8 亚麻多肽分子量分析

利用Superdex 75 prep grade凝胶色谱法测定制备的亚麻多肽的相对分子量。以已知分子量的两种多肽，亚麻胰蛋白酶抑制剂（分子量7 612.71 Da)和化学合成的亚麻苦肽（分子量1 149.46 Da）作为参照，分别将上述标准样及制备的亚麻水解多肽，在相同条件下,上样Superdex 75 prep grade凝胶色谱柱，波长220 nm检测，绘制各自洗脱体积和A220nm吸收值关系曲线，通过与两个已知蛋白的洗脱图谱比对，粗略测定亚麻水解多肽分子量分布范围。

1.9 统计分析方法

试验数据采用Minitab15软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 制备亚麻多肽的蛋白酶筛选

选取6种蛋白酶，在各种酶的最适条件下酶解2 h见表2。

表2 6种蛋白酶酶解亚麻蛋白溶液制备多肽效果的对比Table 2 Comparison of the effect of six proteases on enzymatic hydrolysis of defatted flaxseed meal

由表2可知，3.350酸性蛋白酶酶解亚麻蛋白得率（28.52%）最高，537酸性蛋白酶酶解亚麻蛋白得率（22.97%）次之，因此选用3.350酸性蛋白酶制备亚麻多肽。

2.2 3.350酸性蛋白酶制备亚麻多肽的单因素试验结果

2.2.1 酶解温度对亚麻多肽得率的影响

在酶解时间2 h，加酶量6 000 U/g，pH2.5的条件，酶解温度对亚麻多肽得率的影响见图1。

图1 温度对亚麻多肽得率的影响Fig.1 Effect of temperature on the yield of flax polypeptide

由图1可知，当温度小于60℃时，多肽得率随着温度的升高而增大，温度为60℃时达到最大值，温度大于60℃时，多肽得率有所下降。可能是因为酶解温度较高时，蛋白酶容易变性，从而使酶活性减弱。所以选择60℃为下一步正交试验的酶解温度。

2.2.2 pH值对亚麻多肽得率的影响

pH值对亚麻多肽得率的影响见图2。

图2 pH值对亚麻多肽得率的影响Fig.2 Effect of pH on the yield of flax polypeptides

由图2可知，pH值对水解效果的影响显著，3.350酸性蛋白酶酶解亚麻分离蛋白在加酶量6 000 U/g，酶解温度60℃，酶解时间2 h时，当pH值达到3.0时，多肽得率最大，当pH值大于3.0时，多肽得率略有下降。3.350酸性蛋白酶在pH值较低时酶活较高，所以选取pH3.0为下一步正交试验的酶解pH。

2.2.3 加酶量对亚麻多肽得率的影响

在酶解温度60℃，pH值3.0，酶解时间2 h的条件下，加酶量与多肽得率的关系见图3。

图3 加酶量对亚麻多肽得率的影响Fig.3 Effect of enzyme addition on yield of flax polypeptides

从图3中可以看出，当加酶量为6 000 U/g时，亚麻多肽得率最大，即使增加酶的量也就不会对水解速度有明显的影响，多肽得率反而有所下降。因此，选择蛋白酶添加量为6 000 U/g，作为下一步正交试验的加酶量。

2.2.4 酶解时间对亚麻多肽得率的影响

当酶解温度60℃，pH值3.0，加酶量6 000 U/g时，酶解时间与多肽得率的关系表现为：当酶解时间小于2 h时，随着时间的延长，多肽得率快速上升，2 h时达到最大值，之后再延长酶解时间，多肽得率逐渐下降见图4，这可能是因为随着水解的进行，蛋白质底物逐渐减少，且酶解产物不断积累对蛋白酶本身造成抑制，或者多肽又被进一步酶解成为氨基酸。还可能是因为随着时间延长，多肽之间通过非共价键（如疏水基作用、氢键和配位键）相互聚集，产生了聚合反应，导致多肽减少。因此，选择酶解时间为2 h，作为下一步正交实验的蛋白酶解时间。

图4 酶解时间对亚麻多肽得率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis time on yield of flax polypeptide

2.3 3.350酸性蛋白酶制备亚麻多肽的正交试验结果

综合单因素试验结果，以亚麻多肽得率为指标，进行正交试验，结果见表3。

表3 正交试验设计与结果Table 3 Orthogonal experimental design and results

由表3可知，制备亚麻多肽的最佳工艺组合为A2B1C3D3，即温度 60 ℃、pH2.7、加酶量 6 500 U/g、酶解时间2.5 h，在此条件下进行验证试验，制备亚麻多肽得率的提取率为38.80%。又由极差分析可知，各因素对多肽得率的影响大小顺序为A＞C＞B＞D，即酶解温度对亚麻多肽得率的影响最大，加酶量和pH值次之，酶解时间的影响最小。方差分析结果（表4）表明酶解温度和加酶量对制备亚麻多肽得率的影响显著，其他2个因素的影响均不显著。

表4 方差分析结果Table 4 Analysis of variance

2.4 多肽抗氧化活性分析

2.4.1 亚麻多肽相对还原力的测定

亚麻多肽的还原能力见图5。

图5 亚麻多肽的还原能力Fig.5 Reduction activity of flax polypeptides

由图5可知，在0.15 mg/mL～1.2 mg/mL有效质量浓度范围内，亚麻多肽的还原能力随着质量浓度的升高而增大，且增幅明显。此后，随着质量浓度增大，亚麻多肽的还原能力变化不明显，趋于稳定，逐步达到其最大还原能力。

2.4.2 亚麻多肽对DPPH自由基的清除作用

亚麻多肽对DPPH自由基的清除能力见图6。

图6 亚麻多肽对DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging ability of flax and polypeptide

由图6可知，亚麻多肽DPPH自由基清除率与浓度呈正比，可能是酶解过程产生了能有效清除DPPH·的小分子肽类，当酶解液质量浓度为1.5 mg/mL时，DPPH·清除率达到了最大值89.99%。

2.4.3 亚麻多肽对O2-·自由基的清除作用

亚麻多肽对O2-·自由基的清除能力见图7。

图7 亚麻多肽对O2-·自由基的清除能力Fig.7 The scavenging ability of flax and polypeptide on O2-·free radicals

由图7可知，制备的亚麻多肽清除O2-·能力随质量浓度增加，有明显的增大趋势，当多肽质量浓度为0.6 mg/mL时，清除率可达85.57%；此后，随着质量浓度增大，亚麻多肽对O2-·清除效果变化不明显，趋于稳定，逐步达到其最大的清除O2-·效果。

2.5 亚麻水解多肽分子量的分布范围

亚麻水解多肽分子量分布范围见图8。

图8 亚麻水解多肽分子量分布范围Fig.8 Molecular weight distribution of flax hydrolyzed peptides

通过Superdex 75 prep grade凝胶色谱法，对亚麻水解多肽分子量的分析，揭示亚麻水解多肽在凝胶层析的上洗脱的体积，介于亚麻胰蛋白酶抑制（7 612.71 Da）和亚麻苦肽（MLIPPFFVI，1 149.46 Da)的洗脱体积间，说明利用酸性蛋白酶3.350制备的亚麻水解多肽的分子量分布范围主要集中在1 000 Da～7 600 Da间。

3 结论

3.350 酸性蛋白酶制备亚麻多肽单因素和正交试验，表明制备亚麻多肽的最佳工艺条件为：酶解温度60 ℃、pH2.7、加酶量 6 500 U/g、酶解时间 2.5 h，此条件下亚麻多肽的得率为38.80%。对亚麻多肽得率的影响因素排序为酶解温度＞加酶量＞pH值＞酶解时间，其中酶解温度和加酶量对亚麻多肽得率影响显著。亚麻多肽对DPPH自由基和超氧阴离子自由基有明显的清除作用，说明亚麻多肽具有良好的抗氧化活性，并随着多肽质量浓度的升高，其抗氧化活性不断增强，表现出良好的量效关系，这为亚麻多肽功能性食品开发提供理论依据。制备的亚麻多肽的分子量主要分布在1 000 Da～7 600 Da间的范围，但是亚麻多肽的组成及构效关系有待进一步研究。