烤肉中糖对杂环胺形成的影响及其作用机制研究

韩中惠，王晓敏，吴士莹，张燕

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，食品营养与安全国家重点实验室，天津300457；2.南开大学医学院，天津市食品科学与健康重点实验室，天津300071）

杂环胺（heterocyclic aromatic amines，HAAs）是富含蛋白质的食物在热加工过程中形成的具有多环芳香族结构的致癌致突变物的一类化合物。到目前为止，已经从热加工的肉类中分离鉴定了30多种的杂环胺[1-3]。动物实验证明这些杂环胺具有增加罹患结肠癌、胰腺癌、胃癌和食道癌等疾病的风险[4]。国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）把 PhIP、A&C、MeA&C、MeIQx、8-MeIQx、Trp-P-1、Trp-P-1和Glu-P-1列为2B类可能致癌物，把IQ等列为2A类致癌物[5]。

糖可以作甜味剂、调味剂、增稠剂、着色剂等，在肉制品加工中它也得到了广泛的使用。所以深入研究肉制品中的糖对于杂环胺形成的影响具有十分重要的意义。最近研究人员发现在腌肉汁的配方中添加不同种类的糖会抑制烤鸡肉大多数杂环胺（MeIQ，DiMeIQx，IQ，IQx，Norharman 和 Harman）的形成[6]；蜂蜜中存在的糖类物质可以有效抑制牛肉中杂环胺的形成[7]。虽然关于糖对杂环胺形成的影响已经有很多报道[8-10]，但是他们对于造成这些结果的原因并没有给出明确的解释说明。

糖在肉制品热加工过程中不仅可以发生焦糖化反应，也可以与肉中的氨基酸发生美拉德反应。而α-二羰基化合物恰好是焦糖化和美拉德反应中重要的中间体，且α-二羰基化合物具有高度的化学活性，易进一步发生各种化学反应[11-14]。在肉制品中杂环胺的形成与美拉德等相关反应密切相关，所以肉制品中糖对杂环胺形成产生的影响可能与α-二羰基化合物存在密切的关系。但是目前，仅有糖对杂环胺形成影响的报道，没有关于其与α-二羰基化合物存在关系的报道。

本文采用常见的烤肉食品体系，分析加工过程中糖的种类对杂环胺形成的影响，并探讨作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

PhIP、IQ、MeIQ 和 MeIQx标准品（98%）：加拿大Toronto Research Chemicals公司；丙酮醛（40%水溶液）、乙二醛（40%水溶液）、丁二酮、3-脱氧葡萄醛酮和葡萄糖醛酮：美国Sigma-Aldrich公司；甲酸铵、乙酸铵（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；邻苯二胺：上海阿拉丁生化科技有限公司。

试验所需的猪肉（土猪1号黑猪肉）自天津市经济技术开发区乐购超市。

1.2 仪器与设备

Agilent 6410型高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometer，HPLC-MS/MS）、Agilent 7890B/977A型气相-质谱联用仪（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）：美国 Agilent公司；LC-20A型高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）：日本Shimadzu公司；12通道固相萃取仪：美国Sigma-Aldrich公司；RCT BS 25型磁力搅拌器和MS 3型涡旋混合器：德国IKA公司；FE20K型PH计：瑞士梅特勒-托利多公司；5804R型离心机：美国Beckman公司；MGS-2200型氮吹仪：日本东京理化公司；GR18烤箱：中国澜鑫电烤箱公司；固相萃取柱HyperSep C18（200 mg/5 mL）：美国 Thermo Scientific 公司；固相萃取柱 Si-SCX-2（200 mg/5 mL）：美国 SILICYCLE公司；固相萃取柱HLB：美国waters公司。

1.3 样品的制备

烤肉的加工流程如下：

新鲜的肉→绞肉机绞碎→称取30 g→分别加入不同种类的糖或者α-二羰基化合物→混合均匀→将肉压制成直径10 cm的圆形饼→使用油烤箱在一定温度时间下加工→样品

葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜的加入量分别为0.75、1.5、2.25 g和3 g，考察糖的种类及添加量对杂环胺形成和α-二羰基化合物形成的影响。

烤箱烤制的温度为180℃，烤制的时间为30 min。温度的控制±2℃范围内，时间以秒表准确计时。每组试验重复进行3次。烤制温度时间的是根据实际的食品加工情况设定的。

1.4 杂环胺的检测

1.4.1 样品前处理

在先前已有方法上进行改进，试验步骤参考文献[15-16]。首先，将一定量的碎肉加入氧氧化钠溶液和甲醇均质，并与硅藻土混合，用二氯甲烷洗脱；其次，将洗脱采用丙磺酸阳离子（Si-SCX-2）交换柱和C18固相萃取柱串联萃取；最后，将样品洗脱液用氮气吹干然后用1 mL色谱纯甲醇复溶、稀释，再离心、过0.22 μm有机微孔过滤膜，将制得样品暂存4℃下备用。

1.4.2 杂环胺分析方法

1.4.2.1 高效液相色谱（HPLC）条件

色谱柱为 ZorbaxEclipsePlusC18（2.1mm×150mm，3.5 μm）；柱温为 25 ℃；流速为 0.2 mL/min；流动相：A为甲酸铵（10 mol/L，pH=3.5），B 为乙腈；洗脱梯度为：0～12 min，10%～60%（B）；12 min～14 min，60%～10%（B）；进样的体积为 1 μL。

1.4.2.2 质谱（MS）条件

该质谱使用的离子源为电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI）；其雾化和碰撞的气为氮气；雾化气压力为0.28 MPa；毛细管电压为4 000 V；干燥器流量为10 L/min；干燥器温度为350℃；检测模式为多重反应检测（multiple reaction monitoring，MRM）。杂环胺的质谱跃迁模式分别为：PhIP，m/z 225.3→m/z 210；IQ，m/z 199.2→m/z 184.2；MeIQ，m/z 213.3→m/z 198.2；MeIQx，m/z 214.3→m/z 199.2。

1.5 α-二羰基化合物的检测

1.5.1 样品前处理

参考文献方法并加以改进[17]。首先，取一定量的肉样，加入适当的水/甲醇（1/1，体积比）。其次，移取一定量的上清液，向上清液中加入衍生试剂邻苯二胺（40 mg/mL）溶液水浴。最后，将衍生后的样品经固相萃取柱（HLB柱）纯化，洗脱液过有机滤膜（0.22 μm）备用。

1.5.2 α-二羰基化合物分析方法

1.5.2.1 高效液相色谱（HPLC）条件

色谱柱为 Polar-RP 80 A （2 mm×150 mm，4 μm）柱；柱温设定为25℃；进样体积设为5 μL流动相的流速为0.3 mL/min；流动相选择0.1%甲酸水溶液为A相，甲醇为B相；洗脱的程序如下表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elute program of mobile phase

1.5.2.2 质谱（MS）条件

离子源为ESI；雾化气和碰撞气为氮气；雾化气压力为0.28 Mpa；干燥器温度为350℃；干燥器流量为10 L/min；毛细管电压为4 000 V；检测模式为MRM。α-二羰基化合物被邻苯二胺衍生后的质谱跃迁模式分别为：MGO，m/z 145.1→m/z 77；GO，m/z 131.1→m/z 77；2，3-BD，m/z 159.2→m/z 131；3-DG，m/z 235.2→m/z 199.1；GS，m/z 251.2→m/z 173。

1.6 统计分析

试验所得到的数据以平均值标准偏差（mean±SD）表示。其相关数据通过方差分析（analysis of variance，ANOVA）和邓肯测试（Duncan test）。数据统计分析软件为IBM SPSS 19.0。作图软件为OriginPro 2016。

2 结果与分析

2.1 检测方法验证

为了保证试验测定结果的准确性，对杂环胺和α-二羰基化合物的检测方法进行了详细的方法学考察。其中考察的指标包括线性回归方程、检出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantilty，LOQ）回收率以及相对标准偏差。杂环胺标品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，其线性回归方程、线性相关系数r2值如下表2。

表2 杂环胺的线性回归方程、相关系数及检测限Table 2 Regression equations，correlation coefficients and detection limits for HAAs

样品中杂环胺的检出限LOD和定量限LOQ也在表2显示。IQ，MeIQ，MeIQx和PhIP在样品的回收率分别为78.4%～82.0%，76.8%～82.3%，85.4%～89.3%和75.1%～81.3%。IQ，MeIQ，MeIQx和PhIP的相对标准偏差分别为3.2%～4.5%，3.1%～4.2%，1.4%～3.7%和3.7%～5.2%。结果表明杂环胺各浓度水平的加标回收率和相对标准偏差均能达到检测要求，说明本方法具有较高的准确性和可靠性，适用于本试验检测。

α-二羰基化合物标品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，其线性回归方程、线性相关系数r2值如下表3。

表3 α-二羰基化合物的线性回归方程、相关系数及检测限Table 3 Regression equations，correlation coefficients and detection limits for α-DCs

样品中α-二羰基化合物的检出限LOD和定量限LOQ也在表3显示。MGO，GO，2，3-BD，3-DG和GS在样品的回收率分别为84.8%～90.2%，86.8%～94.8%，87.5%～89.4%，94.8%～97.1%和87.4～89.8%。此外，MGO，GO，2，3-BD，3-DG 和 GS的在样品中相对标准偏差分别为 2.1%～4.7%，2.3%～4.0%，2.4%～5.5%，3.2%～4.2%和1.4%～3.5%。结果表明α-二羰基化合物各浓度水平的加标回收率和相对标准偏差均能达到检测要求，说明本方法具有较高的准确性和可靠性。从以上的试验数据表明，测定杂环胺和α-二羰基化合物的方法具有较高的准确性和可靠性，符合本研究的要求。

2.2 不同种类的糖对烤肉中杂环胺形成的影响

不同种类的糖对烤肉中杂环胺形成的影响见图1。

图1 不同种类的糖对烤肉中杂环胺形成的影响Fig.1 Effect of sugars on the formation of HAAs in oven roasted pork

从图1a可以看出，随着葡萄糖添加量的逐渐增加，生成杂环胺的总量以及PhIP、IQ、MeIQx和MeIQ的量均逐渐降低（p＜0.05），当糖的添加量在1.5 g时，各个杂环胺的生成量显著降低（p＜0.05）；在最大添加量时，杂环胺的降低率均都达到85%以上。

4种添加糖类相比，果糖对各杂环胺的影响与葡萄糖的结果相似，4种杂环胺的含量均随着果糖添加量的增加而降低（图1b）；添加蔗糖时，4种杂环胺在一定程度上降低，但降低程度明显低于葡萄糖和果糖（图1c）；蜂蜜也会对这几种杂环胺的形成产生影响，作用效果强于蔗糖，低于葡萄糖和果糖（p＜0.05）（图1d）。从杂环胺被抑制程度看，这四种杂环胺中，PhIP被抑制的程度最高，IQ的最低。这种现象的形成可能与不同杂环胺之间的前体物密切相关。

2.3 不同种类的糖对α-二羰基形成的影响

肉饼中糖与形成α-二羰基化合物的关系如图2。

图2中表明在烤肉中添加糖（葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜）后有较多数量和种类的α-二羰基化合物形成。随着葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜添加量的增多，丙酮醛的量也逐渐的增加；在添加蔗糖量为3 g时，丙酮醛形成的量最大（图2a）。对于乙二醛，随着各种糖的添加其形成的量较少，在一定程度上其与各种糖的添加量具有一定相关性（图2b）。对于丁二酮，添加蔗糖时形成丁二酮的水平低于检测限，葡萄糖和蜂蜜的添加量小于3 g时，烤肉中也没有丁二酮形成（图2c）。当葡萄糖添加量为0.75 g时，3-脱氧葡萄醛酮的形成量已经达到（462.38±14.81）μg/g，显著高于其它 α-二羰基化合物；但是蔗糖的添加小于或等于1.5 g时，其没有3-脱氧葡萄醛酮的形成（图2d）。葡萄糖醛酮的形成随着葡萄糖、果糖和蜂蜜的添加量均显著增多，而在加蔗糖的肉饼中葡萄糖醛酮没有显著变化（p＜0.05）（图2e）。不同糖影响形成α-二羰基化合物产生的趋势不一样的主要原因可能是不同种类的糖及其产生的α-二羰基化合物之间的反应活性不同造成的。

图2 不同种类的糖对α-二羰基形成的影响Fig.2 Relationship between sugars and α-dicarbonyl compounds in oven roasted pork

2.4 烤肉中杂环胺形成与α-二羰基化合物形成的关系

以上结果表明在烤中葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜的逐渐加入会导致PhIP、IQ、MeIQ和MeIQx的形成量降低，而丙酮醛、乙二醛、3-脱氧葡萄糖醛酮和葡萄糖醛酮的形成量均逐渐增加。那么杂环胺的减少可能与α-二羰基化合物的形成存在一定的关系。对添加各种糖时形成杂环胺的总量与相应的α-二羰基化合物形成总量进行相关性分析（图3）。

数据显示两者之间的皮尔森相关系数（Pearson's r）分别为-0.952 0，-0.938 6，-0.972 7 和-0.974 9。相关性结果分析表明在添加葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜时，样品中α-二羰基化合物的含量与杂环胺的含量均存在负相关性。

图3 α-二羰基化合物与杂环胺之间的相关性Fig.3 Correlations between α-DCs and HAAs

3 结论与讨论

烤肉中，添加葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜均可显著抑制杂环胺（PhIP、IQ、MeIQ 和 MeIQx）的生成，且不同种类的糖对杂环胺的形成均存在显著的量效关系。其中葡萄糖、果糖和蜂蜜对于各种杂环胺的抑制效果明显高于蔗糖。同时，在烤制过程中添加葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜，α-二羰基化合物（丙酮醛、乙二醛、3-脱氧葡萄糖醛酮和葡萄糖醛酮）的产生量显著增加，且均与糖量呈显著量效关系。添加葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜时，α-二羰基化合物的形成总量与杂环胺形成总量之间呈负相关性。推测烤肉中糖对杂环胺形成的影响与α-二羰基化合物的产生有关，该结论与我们报道的模拟体系的研究结论一致，即α-二羰基化合物在糖抑制杂环胺形成中起着重要的作用，本文通过对实际样品中杂环胺形成和α-二羰基化合物形成的相关性分析，进一步证明糖可能通过热降解形成的α-二羰基化合物实现对食品中杂环胺的抑制作用[18]。