表面活性剂对出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的影响
2018-11-22赵廷彬陈畅殷海松孙爱友乔长晟
赵廷彬，陈畅，殷海松，孙爱友，乔长晟，4，*
（1.天津科技大学生物工程学院，天津300457；2.天津现代职业技术学院生物工程学院，天津300350；3.华东理工大学生物反应工程国家重点实验室，上海200237；4.天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心，天津300457）
聚苹果酸（polymalic acid，PMLA）是一种水溶性脂肪族聚酯[1-2]，是苹果酸的聚合物。苹果酸是一种C4二羧酸，分子中含有羟基和羧基，通过分子结构中羧基和羟基间的酯化作用聚合形成PMLA，因此PMLA分子结构中含有大量的酯键、羟基和游离羧基[3-4]。PMLA具有高度的水溶性、吸水性、生物相容性、可降解性、可化学衍生性及无免疫原性等，这些独特的性质决定了PMLA在医药、化妆品、环境治理、可降解材料、食品包装等方面有着广阔的应用前景[5-7]。
出芽短梗霉合成的PMLA是一种胞外产物，在释放过程中如果阻力增大，PMLA会在胞内大量的积累，造成阻遏效应，PMLA的产量会下降，菌体的效能降低。表面活性剂作为一种同时含有亲油基和亲水基的有机化合物，已经被广泛地应用到众多的现代工业领域中[8-9]。有研究表明，表面活性剂能够增大细胞膜的通透性，有利于胞内产物的外排和菌体对周围营养物质的吸收[10-11]。
本文选取4种表面活性剂：十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、曲拉通 X-100（Triton X-100）、吐温 60（Tween 60）、吐温 80（Tween 80），研究它们对出芽短梗霉生长和PMLA合成的影响，并对最佳影响因子的作用机理做了初步探究。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
1.1.1 菌种
出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.3337。
1.1.2 材料
1）斜面培养基：土豆培养基。
2）种子培养基：蔗糖60 g/L，酵母膏3 g/L，丁二酸2 g/L，硫酸铵 1 g/L，K2CO30.4 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，ZnSO4·7H2O 0.005g/L，玉米浆0.1%（体积分数），碳酸钙20 g/L（单独灭菌）。
3）基础发酵培养基（g/L）：蔗糖 100 g/L，蛋白胨35 g/L，KH2PO40.1 g/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，KCl 0.5g/L，MnSO40.05g/L，碳酸钙20g/L（单独灭菌）。
1.1.3 仪器和设备
UVmini-1240紫外/可见分光光度计：日本岛津公司；SKY-2102摇床：上海苏坤实业有限公司；YJ-875S医用超净台：苏州净化设备厂；SPK-250B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LD5-10高速离心机：北京医用离心厂；Agilent 1100高效液相色谱分析仪：美国安捷伦科技有限公司；FACSCalibur型流式细胞仪：碧迪医疗器械（上海）有限公司。
1.2 方法
1.2.1 培养方法
1.2.1.1 斜面培养
将保存于4℃的斜面上的菌取出用接种针转接到新鲜的斜面上，并置于25℃的培养箱中培养3 d～4 d。
1.2.1.2 种子培养
取出培养好的斜面，在无菌操作条件下，用无菌生理盐水将斜面的孢子洗下，制成孢子悬液。然后按照10%（体积分数）的接种量，即取5 mL接种到装有45 mL种子培养基并灭好菌的500 mL挡板瓶中，用8层纱布封好瓶口，置于温度25℃恒温摇床中，转速200 r/min培养40 h。
1.2.1.3 摇瓶发酵培养
将培养好的种子液在无菌条件下混匀，然后按照10%（体积分数）的接种量，即取5 mL接种到装有45 mL基础发酵培养基并灭好菌的500 mL挡板瓶中，用8层纱布封好瓶口，置于温度25℃恒温摇床中，转速200 r/min培养6 d。
1.2.2 分析方法
1.2.2.1 菌体量测定
取10 mL发酵液于50 mL离心管中，5 000 r/min离心15 min。倒掉上清，在菌体沉淀中滴加3 mol/L的稀盐酸溶液，中和发酵液中剩余的碳酸钙，直到不再有气泡产生为止，5 000 r/min离心15 min，倒掉上清。用10 mL生理盐水重悬菌体，5 000 r/min离心15 min，倒掉上清，将离心管置于80℃烘箱中烘干至恒重，称量菌体干重（g/L）。
1.2.2.2 发酵液中PMLA的测定[12]
取10 mL发酵液于15 000 r/min离心10 min除去菌体，用移液管取5 mL上清液于水解反应釜中，同时加入等体积的1 mol/L H2SO4溶液，于90℃条件下水解12 h，将PMLA完全水解为单体苹果酸。高效液相色谱法 （high performance liquid chromatography，HPLC）检测水解前后的苹果酸的含量，两者之差即为PMLA的产量。
HPLC的检测条件如下，色谱柱：Prevail C18色谱柱（4.6 mm×150 mm）；柱温：25℃；流动相（体积比）∶25 mmol/L KH2PO4溶液∶乙腈=95∶5（用磷酸调节pH值至 2.5）；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL；紫外检测波长：210 nm。
1.2.2.3 细胞膜脂肪酸组成的检测
取10 mL发酵液，8 000 r/min离心2 min，弃上清液。向离心管中加入4 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）重悬菌体，8 000 r/min 离心 2 min，弃上清液，重复上述操作2次，收集菌体。按照参考文献[13]中的方法进行菌体脂肪酸的提取与检测。
1.2.2.4 荧光强度测定[14]
取10 mL发酵液，8 000 r/min离心2 min，弃上清液，并用PBS缓冲液洗菌2次。用PBS溶液稀释菌体，使得菌体量控制在106个/mL～107个/mL。取0.5 mL菌体稀释液，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，避光反应30 min后，用流式细胞仪进行检测。
1.2.2.5 电镜检测
参考文献[15]中的试验方法进行出芽短梗霉细胞膜结构检测。
2 结果与讨论
2.1 SDS对出芽短梗霉生长和PMLA合成的影响
在发酵培养基中分别加入浓度为0、0.05、0.1、0.5、1.0 g/L的阴离子型表面活性剂SDS，摇床发酵6 d，测定其菌体生长和产PMLA的情况，结果如图1所示。
从图1中可以看出，随着SDS浓度的增加，出芽短梗霉发酵后的细胞生物量和PMLA的产量都呈下降趋势，并且菌体生物量和PMLA的产量都比空白组低，说明SDS对发酵过程抑制作用比较明显。随着SDS添加量的增大，菌体生物量和PMLA产量的下降的幅度逐渐变小。当SDS添加量达到0.5 g/L后，菌体生物量和PMLA产量就不再发生较大的变化。由此得出，较低浓度的SDS对出芽短梗霉的生长和PMLA的合成表现出了较强的抑制能力。
图1 添加SDS对出芽短梗霉生长和PMLA合成的影响Fig.1 Effect of SDS addition on PMLA production and cell growth by A.pullulans
2.2 曲拉通X-100对出芽短梗霉生长和PMLA合成的影响
在发酵培养基中分别加入质量浓度为0、5、10、20、40 g/L的曲拉通X-100，摇床培养6 d后，测定其菌体生物量和PMLA产量，结果如图2所示。
图2 添加Triton X-100对出芽短梗霉生长和PMLA合成的影响Fig.2 Effect of Triton X-100 addition on PMLA production and cell growth by A.pullulans
从图2中可以看出，加入曲拉通X-100后，生物量和PMLA产量的变化趋势是不一致的。当曲拉通X-100浓度小于10 g/L时，PMLA产量随曲拉通X-100添加量的增加先降低后升高，并当曲拉通X-100浓度为5 g/L时，PMLA的产量最低，是17.21 g/L，其产量较对照组下降了36.89%。当曲拉通X-100浓度高于10 g/L后，随曲拉通X-100浓度增大PMLA产量逐渐下降。整体来看，曲拉通X-100对PMLA的产量没有提高作用。但加入曲拉通X-100可以促进出芽短梗霉细胞的生长，随着曲拉通X-100浓度的增大，生物量先上升，随后有所下降，并在曲拉通X-100浓度为5 g/L时，生物量达到最大。结合曲拉通X-100对生物量和PMLA产量的影响，可以得出，在低浓度曲拉通X-100范围内（小于5 g/L），培养基中的碳源主要用于菌体生长，由于对碳源的竞争性利用，导致PMLA产量下降。在高浓度范围内（大于5 g/L），虽然菌体量和空白组相接近，但在菌体内部PMLA合成酶系可能受到高浓度曲拉通X-100的抑制，导致PMLA的产量低于对照组。
2.3 吐温60对出芽短梗霉生物量和PMLA产量的影响
在发酵培养基中分别加入质量浓度为0、1、2、5、10、15 g/L的吐温60，摇床培养6 d后，测定其菌体生物量和PMLA产量，结果如图3所示。
图3 添加Tween 60对出芽短梗霉生长和PMLA合成的影响Fig.3 Effect of Tween 60 addition on PMLA production and cell growth by A.pullulans
从图3中可以看出，加入吐温60对出芽短梗霉菌体生长和PMLA合成的影响是有区别的。在较低浓度范围内（吐温60浓度小于2 g/L），PMLA的产量随吐温60添加量的增加而提高，并在吐温60浓度为2 g/L时PMLA产量最高，达到28.87 g/L，较对照组产量提高了20.86%。而添加吐温60对于出芽短梗霉菌体生长有促进作用，并在适当的浓度范围内（吐温60浓度小于5 g/L），菌体量随着吐温60添加量的增多而增大。
2.4 吐温80对出芽短梗霉生长和PMLA产量的影响
在发酵培养基中分别加入质量浓度为0、1、2、5、10、15 g/L的吐温80，摇床培养6 d后，测定其菌体生物量和PMLA产量，结果如图4所示。
图4 添加Tween 80对出芽短梗霉生长和PMLA合成的影响Fig.4 Effect of Tween 80 addition on PMLA production and cell growth by A.pullulans
由图4可知，随着吐温80浓度增加，PMLA的产量较空白对照组有所提高，并在吐温80添加量为2 g/L时PMLA产量最高，达到31.36 g/L，较空白对照组提高了30.5%。但当吐温80浓度大于10 g/L时，PMLA的产量急剧下降，并且低于空白对照组。菌体生物量随着吐温80的添加，浓度有所提高，说明吐温80能促进出芽短梗霉菌体的生长。
由以上试验可得，吐温60和吐温80对出芽短梗霉产PMLA都有促进作用，且吐温80比吐温60的作用效果好，因此选用吐温80作为最佳影响因子进行后续试验。
2.5 吐温80对出芽短梗霉细胞脂肪酸组成的影响
吐温80的添加对细胞脂肪酸组成成分的影响见表1。
表1 吐温80的添加对细胞脂肪酸组成成分的影响Table 1 Fatty acid composition of A.pullulans cells grown with and without Tween 80
出芽短梗霉细胞含有的脂肪酸主要有棕榈酸（C16：0），棕榈油酸（C16：1），硬脂酸（C18：0），油酸（C18：1），亚油酸（C18：2）。在吐温 80 存在的情况下，不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例从2.11上升到了2.85，比重提高了25.96%。脂肪酸不饱和度的提升主要是因为棕榈酸含量的下降以及亚油酸含量的增加。
脂肪酸不饱和键的含量和链长会影响细胞膜的流动性，不饱和键含量越高，膜脂的流动性和通透性就会越大。细胞膜的通透性的增强，更加有利于菌体细胞从周围环境中摄入营养物质，同时使得胞内物质更加容易的往胞外分泌[15-16]。
2.6 吐温80对出芽短梗霉细胞膜通透性的影响
利用流式细胞仪测定碘化丙啶（PI）染色的细胞荧光强度的变化，考察了吐温80对细胞膜通透性的影响。荧光染料PI是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色[14]，流式细胞仪检测吐温80对细胞膜通透性的影响见图5。
图5 流式细胞仪检测吐温80对细胞膜通透性的影响Fig.5 Effect of Tween-80 on cell membrane permeability of A.pullulans assessed by flow cytometry
通过差速离心法去除碳酸钙，收集菌体细胞，加入PI染色液，暗反应30 min后进行检测。从图5中可以看出，出芽短梗霉在不同发酵条件下荧光强度是不同的。空白组荧光强度平均值为8.74，试验组荧光强度平均值为12.19，荧光强度提高了39.47%。试验组荧光强度高于空白对照组，说明加入吐温80使得菌体细胞膜的通透性得到了提高。
2.7 吐温80对出芽短梗霉细胞膜结构的影响
透射电镜结果图见图6。
在添加和不添加2 g/L吐温80的情况下，利用透射电镜观察了出芽短梗霉的细胞膜的结构。由图6可知，在添加吐温80的情况下细胞膜的结构与不添加时是有明显的差异的。空白组中，细胞膜是规则的、清晰的、圆润紧凑的。试验组中，细胞膜是不规则的、松散的，有一定程度的内凹和折叠，并且能够观察到微小空洞的出现。出芽短梗霉细胞膜形态发生变化可能是因为吐温80与膜磷脂双分子中的脂质部分发生了相互作用[10]。
图6 透射电镜结果图Fig.6 Transmission electron microscope results
3 结论
研究发现不同表面活性剂对出芽短梗霉生长和PMLA生产的影响各不相同，SDS和曲拉通X-100对PMLA的合成有抑制作用，不利于PMLA的合成。吐温80和吐温60在低浓度时有利于PMLA的合成，最适添加量都是2 g/L，吐温80比吐温60的作用效果更好。添加吐温80后，PMLA的产量为31.36 g/L，较对照组提高了30.5%。选择吐温80作为最佳影响因子时，胞内脂肪酸含量检测结果显示，不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率提高，这使得细胞膜的流动性增强；同时细胞膜结构变得松散，通透性增强，有利于PMLA往胞外分泌。
