阳荷挥发油提取工艺优化及GC-MS分析
2018-11-22蔡依徐津林郭百臻李肖段金辉阮金兰
蔡依，徐津林，郭百臻，李肖，段金辉，阮金兰，*
（1.武昌理工学院生命科学学院，湖北武汉430223；2.武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北武汉430073）
阳荷系姜科姜属多年生草本植物（Zingiber striolatum Diels），广泛分布四川、贵州、广西、湖北、湖南、江西、广东等地[1]；生于林荫下、溪边，海拔300 m～1 900 m。阳荷是野生蔬菜，一年种植多年生长，能经受较恶劣的环境磨炼，生命力极强，基本上无病虫害，无须使用农药，且多地均有栽培。阳荷[2]是食药同源，嫩芽、茎果味道香甜，可直接烹饪食用，富含有丰富的膳食纤维、必需氨基酸和蛋白质等，具有活血、化瘀、降血糖、治疗痛经[3]等作用。现阶段，国内外对阳荷的研究主要集中在膳食纤维、红色素、多糖和降血糖等方面[4-6]，对阳荷挥发油相关的报道甚少。挥发油[7]又称精油，是天然植物的活性成分之一，具有分子量小，可随水蒸气蒸出等特点，其化学成分复杂，具有抗炎、抗过敏、抗氧化、抑菌和抗肿瘤等作用[8-9]。作者课题组前期研究发现阳荷提取物能明显地降低糖尿病实验动物的血糖，极具深入研究价值，本试验采用单因素试验、多因素多水平的正交试验、超声辅助蒸馏法提取阳荷挥发油[10]并优化阳荷挥发油的提取工艺，气相色谱-质谱（gass chromatography-mass spectormetry，GC-MS） 分析阳荷挥发油的化学成分，以期为阳荷的深入研究与开发，充分发掘阳荷资源利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
阳荷：湖北省恩施利川现代农业公司，经本课题组阮金兰教授鉴定为阳荷Zingiber striolatum Diels。
无水乙醚（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Agilent 7890A-5975C型气质联用仪：美国Agilent公司；ZNHW型电热套：上海越众仪器设备有限公司；TQ10超纯水机：上海精密仪器仪表有限公司。
1.3 方法
1.3.1 挥发油的提取
提取方法[11]：本试验采用超声辅助蒸馏提取法提取阳荷挥发油，并计算挥发油的提取率，提取率/%=挥发油重量（g）/阳荷重量（g）×100。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 超声时间的考察
准确称取100 g打浆后的阳荷5份，以1∶2.5（g/mL）的料液比加入纯化水，搅拌均匀，分别超声30、40、50、60、70 min，然后蒸馏提取3 h，收集蒸馏液，分别用无水乙醚萃取挥发油，回收乙醚完全以后计算提取率。
1.3.2.2 蒸馏时间的考察[12]
准确称取100 g打浆后的阳荷5份，以1∶2.5（g/mL）的料液比加入纯化水，搅拌均匀，用1.3.2.1中的最佳超声时间超声，分别蒸馏 1、2、3、4、5 h，收集蒸馏液，分别用无水乙醚萃取挥发油，回收乙醚完全以后计算提取率。
1.3.2.3 料液比的考察
准确称取100 g打浆后的阳荷5份，分别以1∶1.5、1 ∶2、1 ∶2.5、1 ∶3、1 ∶3.5（g/mL）的料液比加入纯化水，以1.3.2.1中的最佳超声时间超声，用1.3.2.2中的最佳蒸馏时间蒸馏提取，收集蒸馏液，分别用无水乙醚萃取挥发油，回收乙醚完全以后计算提取率。
1.3.3 正交试验[13]
在1.3.2中的单因素试验的基础上，选取提取时间、料液比及超声时间3个影响因素，以挥发油提取率为评价指标，采用三因素三水平的正交试验方法进行正交试验，并进行比较试验，确定最佳提取工艺。
1.3.4 验证试验[14]
为保证工艺的重复性和可行性，对最佳提取工艺进行验证试验，以阳荷挥发油提取率为评价指标，并计算RSD值。
1.3.5 GC-MS分析[15-17]
色谱条件：DB-5MS色谱柱（0.24 mm×30 m，0.25 μm），载气为氦气，进样口温度为250℃，流速为1.0 mL/min，程序升温，进样量为0.2 μL。质谱条件：电离方式为EI，电子能量为70 eV，离子源温度260℃，接口温度为260℃，全扫描采集，扫描范围m/z40～600。质谱数据库为NIST4.0。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 超声时间对阳荷挥发油提取率的影响
超声时间对阳荷挥发油提取率的影响见图1。
图1 超声时间对阳荷挥发油提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction rate of volatile oil from Zingiber striolatum Diels
如图1所示，随着超声时间的增加，阳荷挥发油的提取率逐渐升高，在超声60 min时达到峰值，提取率达到0.031 2%，超声时间超过60 min后挥发油提取率开始下降。因此，确定较佳超声时间为60 min。
2.1.2 蒸馏时间对阳荷挥发油提取率的影响
蒸馏时间对阳荷挥发油提取率的影响见图2。
图2 蒸馏时间对阳荷挥发油提取率的影响Fig.2 Influence of distillation time on the extraction rate of volatile oil from Zingiber striolatum Diels
如图2所示，随着蒸馏时间的增加，阳荷挥发油的提取率逐渐升高，在蒸馏4 h时达到峰值，提取率达到0.027 6%，蒸馏时间超过4 h后挥发油提取率开始下。因此，确定较佳蒸馏时间为4 h。
2.1.3 料液比对阳荷挥发油提取率的影响
料液比对阳荷挥发油提取率的影响见图3。
图3 料液比对阳荷挥发油提取率的影响Fig.3 Influence of solid-liquid ratio on extraction rate of volatile oil from Zingiber striolatum Diels
如图3所示，随着料液比的增加，提取率逐渐升高，在1∶3（g/mL）时达到峰值，阳荷挥发油提取率达到0.026 6%，在1∶3.5（g/mL）后提取率开始下降。因此，较佳料液比为 1 ∶3（g/mL）。
2.2 正交试验结果
正交因素水平表的设计：根据单因素试验结果，设计L9（33）表，以阳荷挥发油的提取率为综合评价指标，因素水平安排见表1，正交试验结果见表2和表3。
表1 因素水平表Table 1 Factors and levels
表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal experimental results
表3 正交试验的方差分析Table 3 Analysis of variance in orthogonal experiments
对上述正交试验结果进行直观分析和方差分析，K值越大表示该水平对提取率的影响越大，影响阳荷挥发油提取率的主次因素为A＞C＞B，即超声时间＞料液比＞蒸馏时间。通过比较K值，选择K值最大的因素水平即为最佳提取工艺，最佳提取方案是A3B2C2。
依据正交试验结果，依次对A、B、C 3个因素进行方差分析[18]，分别计算离差平方和、自由度、均方、F和P。由表3分析可知，因素A对阳荷挥发油的提取率有决定性影响，因素B和因素C对阳荷挥发油的提取率均无显著性影响。
2.3 比较试验
将最佳提取工艺A3B2C2，与正交表中第8组A3B2C1进行比较试验，结果见表4。
表4 比较试验Table 4 Comparison experiments
正交表优选方案A3B2C2提取率高于正交表中第8组A3B2C1的提取率，因此最佳提取方案是A3B2C2，超声 60 min，蒸馏时间 4 h，料液比为 1 ∶3（g/mL）。
2.4 验证试验
以正交试验的最优化方案A3B2C2提取阳荷挥发油，重复3次，结果如表5所示。
表5 验证试验Table 5 Validation experiment
图4 阳荷挥发油总离子流色谱Fig.4 Total ion chromatogram of volatile oil from Zingiber striolatum Diels
表6 阳荷挥发油成分及相对含量Table 6 Composition and relative content of the volatile oil of the Zingiber striolatum Diels
阳荷挥发油提取率分别为0.036 8%、0.036 4%和0.035 9%，RSD值等于1.23%，证明优选工艺稳定可行，重复性好。
2.5 阳荷挥发油化学成分分析
采用GC-MS技术对阳荷挥发油进行成分分析，获得总离子流色谱图，见图4。从阳荷挥发油中鉴定出17种物质，结果见表6。
所得挥发油大多为烯烃类组分，其中含量较高的有棕榈酸（30.508%）、β-水芹烯（12.359%）、芥酸酰胺（7.376%）、α-律草烯（6.501%）、正十七烷（4.830%）、亚油酸（4.147%）、亚麻酸甲酯（3.242%）、β-蒎烯（3.065%）、4-（1-甲基乙基）-2-环己烯-1-酮（2.196%）。
王军民等[19]采用水蒸气蒸馏法提取阳荷挥发油，提取率高达2.605%，共鉴定出55个化学成分，占化合物总数的93%，含量较高的有柠檬烯（26.695%）、α-蒎烯（3.683%）、β-蒎烯（4.292%）、α-石竹烯（5.328%）等，与本试验的阳荷挥发油提取率和挥发油成分差异较大。王军民等所使用的阳荷采自云南省西畴县，本试验所使用的阳荷采自湖北恩施。王军民等采用单一水蒸气蒸馏法、石油醚萃取挥发油，本试验采用超声辅助蒸馏提取法、无水乙醚萃取。后期本课题组将购买云南省西畴县所产阳荷，通过试验比较不同产地、提取方法、萃取溶剂对阳荷挥发油、化学成分的影响。
3 结论
挥发油是阳荷的主要化学成分类别之一，具有广泛的生理活性，随着天然植物现代化的深入开展，挥发油的成分分析成为热点之一。本试验通过单因素试验和多因素多水平的正交试验对阳荷挥发油的提取工艺进行了研究。应用GC-MS技术分析了阳荷挥发油的主要化学成分，得到了最佳提取工艺为：超声60 min，蒸馏时间 4 h，料液比为 1 ∶3（g/mL）。在此提取条件下阳荷挥发油提取率可达到0.036 8%，提取方法可行，具有简单快捷的特点。通过GC-MS数据库共鉴定出所得挥发油中17个主要化学成分，其中8个是烯烃类化合物，棕榈酸含量高达30.508%。本试验优化了阳荷挥发油的提取工艺，采用GC-MS技术分析了阳荷挥发油主要成分，为阳荷资源合理开发提供了科学试验依据。
