山西酸枣仁药材指纹图谱研究

李飞鹤，聂 菁，赵建斌，王玉龙

（山西振东制药股份有限公司，山西太原030600）

酸枣仁是鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子，主要分布于河北、陕西、内蒙古、辽宁、山东、山西等地，味甘、酸，性平，具有养肝、宁心、安神、敛汗之功效，用于治疗虚烦不眠、惊悸怔忡、体虚自汗、盗汗等，为安心养神的首选中药。2015版药典中酸枣仁含量测定项以酸枣仁皂苷A和斯皮诺素为指标［1］，未能全面控制药材质量，导致掺假现象严重。

尽管近年来关于酸枣仁指纹图谱的研究报道较多，但通过指纹图谱对山西地区酸枣仁药材质量控制的报道却很少，其主要原因包括样品处理耗时太长；很多中小型中药生产企业及药材批发企业不具备超高效液相设备及ELSD检测器等检测设备，无法开展；可参照的指纹图谱清晰度不够，导致同属性状接近的掺假药材很难辨别。

本研究主要在前人研究的基础上加以改善优化，以实际可用为出发点进行研究归纳。在张志裴等［2］的研究基础上主要进行了3项改进：液相条件梯度洗脱的优化，使图谱中各成分的分离更加清晰；供试品脱脂的总时间缩短6 h且脱脂过程安排更加科学合理；新增了斯皮诺素的指认。在闫艳［3］、李游等［4］研究的基础上进行了液相条件及供试品提取方法的优化，使图谱中各成分的分离更加清晰，在保证有效成分提取效率的前提下样品制备更加简单易行；而崔思娇等［5］研究采用超高效液相色谱仪，对中小药材收购销售企业不具普适性，且会增加检测成本。

本研究采集了大量产地的酸枣仁，经仪器初测筛选出最具代表性的产地作为本文研究对象，通过高效液相色谱法的系统研究，确定了酸枣仁指纹图谱的共有模式，不仅为药典中酸枣仁鉴别项中未来增加指纹图谱项提供参考依据，也为打击市场酸枣仁药材掺假、以次充好的行为辅以科学的法律准绳。另外，该方法在做指纹图谱时可同时进行斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、B的含量测定（本研究由于部分样品量太少，未做含量测定），为酸枣仁的全面质量控制提供充分的理论依据。

1 仪器与试药

赛默飞UltiMate3000高效液相色谱仪，DAD检测器，OHAUS EX125ZH分析天平（十万分之一级），KQ5200E型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；斯皮诺素对照品（批号 170217，纯度＞98%）、酸枣仁皂苷A对照品（批号170311，纯度＞98%）、酸枣仁皂苷B对照品（批号161231，纯度＞98%），均由上海融禾医药科技有限公司提供；酸枣仁对照药材（批号121517-201604），由中国食品药品检定研究院提供；酸枣仁样品14批，均由山西振东道地药材开发有限公司提供，经山西中医药大学裴妙荣教授鉴定为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa （Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟种子；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸、醋酸、甲酸为优级纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

表1 酸枣仁样品来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm 反相色谱柱；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：203 nm；流动相：以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱。理论塔板数按斯皮诺素计算应不低于100 000。结果见表2。

表2 梯度洗脱

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成1 mL中分别含1 mg以上3种对照品的溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取适量酸枣仁于60℃条件下干燥24 h，粉碎，过三号筛，将酸枣仁粉末置于索氏提取器，用石油醚（60℃～90℃）脱脂2次，每次3 h，回收石油醚，后将脱脂粉末挥尽残醚至无醚味。取脱脂粉约1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入90%甲醇25 mL，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量，补足损失的甲醇，摇匀，滤过，滤液于水浴锅上蒸干，残渣用甲醇转移至5 mL的容量瓶，定容，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，备用。

2.3 专属性考察

分别精密吸取空白溶剂、对照品斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和B的混合溶液及供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录110 min内的色谱峰。在前述色谱条件下，空白溶剂甲醇对测定无干扰，对照品溶液斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和B分别于38.2 min、78.6 min 和 80.2 min 出峰，供试品溶液的对应位置也出现相应的峰，色谱图见图1，显示专属性良好。

图1 空白溶剂、供试品、对照品液相色谱图

2.4 提取方法考察

2.4.1 提取溶剂考察 分别考察了甲醇、90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇、60%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、无水乙醇、70%乙醇、稀乙醇、30%乙醇作为溶剂进行提取的结果，通过比较各比例溶剂提取后斯皮诺素和酸枣仁皂苷A、B的相对峰面积以及整体色谱图的分离效果，可以看出以各比例甲醇提取的色谱信息较为全面，且各色谱峰分离度较好，而在甲醇中尤以90%甲醇的提取效率较高且整体色谱峰分离度最佳，详见图2。综合以上考虑，最终选用90%甲醇作为提取溶剂。

图2 各比例甲醇及乙醇色谱图

2.4.2 提取方式考察 以90%甲醇为溶剂，提取方法分别采用超声提取10 min、20 min、30 min、40 min、60 min，放冷，以90%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液。见表3，对于斯皮诺素，超声40 min提取效率最高，而对酸枣仁皂苷A、B超声30 min以上提取效率变化很小，兼顾三者的提取效率及提取时间，选定超声30 min进行样品提取。

表3 超声时间对提取效率的影响

2.5 精密度试验

将供试品溶液连续进样6次，各色谱峰保留时间及峰面积的RSD均小于2.72%。

2.6 稳定性试验

取供试品按上述方法进行制备，分别于配制后 0 h、4 h、8 h、16 h、24 h、28 h，依法测定，结果表明，供试品溶液在28 h内基本稳定，各色谱峰保留时间及峰面积的RSD均小于2.57%。

2.7 重复性试验

取同一批次样品6份（7号样品），平行测定，各指纹图谱相似度均大于0.98。

2.8 指纹图谱共有模式

将14批酸枣仁药材及对照药材的色谱图作为代表性图谱，采用中国药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价软件2.0版，均值法计算共有峰的峰面积，从而得到酸枣仁药材指纹图谱的共有模式，生成对照指纹图谱，经指纹图谱相似度软件计算，相似度均在0.94以上，见图3。

图3 各样品指纹图谱及生成对照指纹图谱

2.9 指纹图谱耐用性考察

除在以上实验采用的条件外，仪器UltiMate 3000，色谱柱 Kromasil 100-5-C18，5 μm（4.6 mm×250 mm），流速 1.0 mL/min，柱温 35℃的条件以外，还采用了另外两种色谱柱：Phenomenex Luna C18，5 μm（4.6 mm ×250 mm），Agilent Prep-C18，5 μm（4.6 mm×250mm）；另外两种流速：0.9 mL/min，1.1 mL/min；另外两种柱温：30℃、40℃。取同一供试品溶液，仅改变上述的一种条件进行测定，与对照指纹图谱进行比较，指纹图谱相似度均大于0.90，结果见图4。

图4 指纹图谱耐用性考察

3 讨 论

本研究主要针对我省中药材市场酸枣仁的掺假、以次充好的买卖行为进行，期望增加简单易行的检测手段以减少或遏止这些不良行为，以净化药材饮片市场，保证中药原料的安全。通过系统的方法学研究，制定了切实可行的酸枣仁指纹图谱，为该药材进行科学合理的质量评价提供了充分的理论依据，且研究所用设备耗材均为常规可用，对药材经营使用者皆具可实施性。

本文是以酸枣仁中的斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、B为拟研究对象进行研究的，且进行了详细的样品提取方法研究，因此极有可能可同时测定三者的含量，后续需补加回收率、线性等进行含量测定的方法学验证。测定时需要同时采集三者的最大吸收波长，且需要考虑原药材与脱脂粉的转化率，便于后期含量的计算。本研究由于样品采集较困难样品量很少，因此未做前述后续研究。