抵当汤对颈动脉损伤后再狭窄大鼠VEGF-A、AngⅡ的影响

孙 志 ，张作记 ，刘 妍

（1.南京中医药大学国家重点省部共建针药结合实验室，江苏南京210023；2.济宁医学院中华行为医学与脑科学杂志编辑部，山东济宁272067）

经皮冠状动脉介入治疗（PCI）是冠心病最有效的治疗方法之一，因其可使狭窄的管腔减少至20%～50%以下，血流显著恢复，心绞痛消除或显著减轻，心电图变化改善，受到广泛欢迎。但经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）治疗后半年内30%～50%的患者发生再狭窄，金属裸支架植入术后半年内支架内再狭窄（ISR）率为 20%～30%［1］，药物洗脱支架植入后半年内支架内再狭窄率仍为10%［2］。解决PCI术后支架内再狭窄仍是需要研究的重要课题。临床实践发现，抵当汤可有效抑制冠心病患者PCI术后再狭窄。为探讨其机制，本文观察了抵当汤对颈动脉损伤后再狭窄大鼠血管内皮生长因子（VEGF-A）、血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级8 w龄SD雄性大鼠50只，体质量（280～300）g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2013-0016。控制室温20℃～22℃，湿度50%～60%。

1.1.2 试剂与仪器 手术刀、眼科剪、眼科镊、血管钳、微型小血管夹、3/0无菌医用结扎线，可吸收性（胶原蛋白）外科缝合线（山东博达医疗用品有限公司生产）等。阿司匹林肠溶片，规格25 mg，烟台只楚药业有限公司生产，国药准字H37023155。中药水蛭、虻虫、桃仁、酒制大黄（购自亳州中药公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模 50只大鼠适应性饲养1 w后，随机分为正常组、模型组、中药大剂量组、中药小剂量组和西药组，每组10只。除正常对照组大鼠外，各组大鼠称重后用25%乌拉坦腹腔注射（5 mL/kg）麻醉，仰卧固定于手术台上。依照文献［3-4］方法，在无菌条件下从大鼠颈部取正中切开颈部皮肤，分离皮下组织、颈动脉血管鞘及与颈总动脉伴行的迷走神经，暴露右颈总动脉及右颈内、外动脉。结扎颈外动脉远心端和甲状腺上动脉，用微型小血管夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉以暂时阻断血流。从右颈外动脉上剪一切口，从切口向心方向插入自制导管［2-0或3-0可吸收性（胶原蛋白）外科缝合线，前端稍后用刀轻划使其粗糙］至颈总动脉，进入至颈总动脉距离颈内外动脉分叉处1 cm，用手轻压动脉，使其回拉时产生轻度阻力，将导管回拉至颈内外动脉分叉处，重复上述过程5~6次，退出导管。结扎颈外动脉切口两端，松开颈总动脉和颈内动脉的微型血管夹，恢复血流，缝合伤口。术后常规肌注青霉素10万u，连续3 d。

1.2.2 干预方法 将抵当汤方药（水蛭、虻虫、桃仁、酒制大黄按等量比例）水煎2次，煎出液浓缩至浓度为0.36 g/mL（每毫升含生药量）。中药大剂量组以2.4 g/kg生药剂量灌胃，小剂量组以1.2 g/kg生药剂量灌胃。西药组用肠溶阿司匹林30 mg/kg灌胃，模型组和正常对照组均以等容积生理盐水灌胃。各组均于术前2 d开始给药，用药至术后2 w。均于每天早晨8：00进行。

1.2.3 组织取材 大鼠于术后第2周禁食14 h，次日清晨称重后，以20%的乌拉坦（氨基甲酸乙酯）5 mL/kg腹腔注射麻醉，从大鼠腹主动脉取血，存于EDAT抗凝管，静置5 min，4 000 prm离心2 min，取血浆，装入1.5 mL离心管内，-20℃冻存待检。取出右颈总动脉约1 cm，0.9%氯化钠溶液漂洗，并将动脉平均分为两段，其中一段浸入4%多聚甲醛中固定12～24 h，制备石蜡标本，用于光镜下HE染色观察动脉形态。1.2.4 指标检测 血浆胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）：将冷藏的血浆样本送至南京裴尔森生物科技有限公司检测。血管内皮生长因子（VEGFA）：酶联免疫吸附法（ELISA）检测。血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）：酶联免疫吸附法（ELISA）检测。

1.3 统计学方法

运用SPSS11.5统计软件进行统计分析，数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用独立样本t检验，多组两两比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠动脉血管形态学分析

正常对照组大鼠动脉管腔面积大，管壁仅一层内皮细胞，且紧贴内弹力板，内弹力板完整。模型组大鼠颈动脉内膜显著增厚，可见大量平滑肌细胞及细胞外基质，内弹力板有破坏、断裂，中膜可见损伤，外膜增厚，动脉管腔狭窄。说明造模成功。大剂量组、小剂量组和西药组大鼠颈动脉内膜增厚程度与模型组比较均明显减轻，但以小剂量组最为显著，其改善程度接近正常组。结果见图1。

2.2 各组大鼠血脂水平比较

实验过程中，模型组和小剂量组各死亡1只。各治疗组大鼠TC、TG含量均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）。小剂量组和西药组大鼠TC含量显著低于大剂量组（P＜0.01），小剂量组和西药组大鼠TC含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。小剂量组大鼠TG含量显著低于大剂量组（P＜0.01），西药组与大小剂量组比较差异无统计学意义。结果见表1。

表1 各组大鼠血脂水平比较 （±s）

表1 各组大鼠血脂水平比较 （±s）

注：与模型组比较，1）P＜0.01；与大剂量组比较，2）P＜0.01；与小剂量组比较，3）P＜0.01

组别 n TC（mmol/L） TG（mmol/L） LDL-C（mmol/L） HDL-C（μmol/L）正常对照组 10 3.08±0.18 0.99±0.08 2.96±0.16 580.00±46.37模型组 9 2.74±0.31 0.89±0.05 2.66±0.32 654.25±67.54大剂量组 10 2.36±0.151） 0.82±0.021） 2.22±0.151） 805.75±60.091）小剂量组 9 2.04±0.151）2） 0.76±0.041）2） 1.86±0.131）2） 928.71±39.071）2）西药组 10 2.09±0.091）2） 0.80±0.021） 2.08±0.081）3） 847.83±36.601）3）

各治疗组大鼠LDL-C含量均低于模型组（P＜0.01）；小剂量组显著低于大剂量组和西药组（P＜0.01），西药组与大剂量组比较差异无统计学意义。

各治疗组大鼠HDL-C含量均高于模型组（P＜0.01）；小剂量组显著高于大剂量组和西药组（P＜0.01），西药组与大剂量组比较差异无统计学意义。

说明大、小剂量抵当汤和西药阿司匹林均能降低大鼠TC、TG、LDL-C含量，升高大鼠HDL-C含量，且以小剂量抵当汤效果为佳。

图1 各组大鼠动脉血管形态学分析

2.4 各组大鼠血管内皮生长因子（VEGF-A）、血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）水平比较

VEGF-A、Ang-Ⅱ水平模型组显著高于正常对照组（P＜0.01），各治疗组显著低于模型组（P＜0.01）。小剂量组VEGF-A水平显著低于大剂量组和西药组（P＜0.05），西药组显著低于大剂量组（P＜0.05）。小剂量组Ang-Ⅱ水平显著低于大剂量组和西药组（P＜0.01），西药组和大剂量组比较差异无统计学意义。说明大、小剂量抵当汤和西药阿司匹林均可降低血浆VEGF-A、Ang-Ⅱ水平，从而达到抑制内膜增生及血管紧张的作用，而以小剂量抵当汤作用最佳。结果见表2。

表2 各组大鼠VEGF-A、Ang-Ⅱ水平比较 （Pg/mL±s）

表2 各组大鼠VEGF-A、Ang-Ⅱ水平比较 （Pg/mL±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01；与大剂量组比较，3）P＜0.05，4）P＜0.01；与西药组比较，5）P＜0.05

组别 n VEGF-A Ang-Ⅱ

3 讨论

经皮冠状动脉介入治疗（PCI）后发生再狭窄的原因有多个方面，包括血管内皮细胞损伤、持续存在的相关炎症反应、血管平滑肌细胞（VSMC）的过度增殖与迁移以及血管新生内膜组织过度增生等。血管内皮生长因子-A（VEGF-A）是血管内皮生长因子家族的重要一员，特异作用于血管内皮细胞，是强有力的有丝分裂原。研究表明，VEGFA可促使血管内皮细胞增殖，抑制血管内皮细胞的凋亡，诱导血管平滑肌细胞的迁移，促进血管平滑肌细胞合成和分泌基质金属蛋白酶，并加速基质降解以及趋化炎症细胞等，最终促使新毛细血管生成及其功能成熟［5］。局部缺血、缺氧是促进VEGF-A分泌的最主要因素［6］。研究表明，VEGFA与冠心病患者再发心血管事件呈正相关［7］。VEGF-A可促进斑块内血管发生，诱导斑块内出血及促进斑块的进展，参与了冠状动脉粥样硬化性疾病的病理生理［8］。本实验研究表明，大鼠颈动脉损伤后血清VEGF-A水平显著增高，与文献报道相符。

血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的重要效应因子，不仅具有收缩血管的作用，还可通过氧化激活和炎症反应诱导高血压的发生，并能诱导内皮功能异常和炎症反应［9］，炎症和内皮功能异常是动脉粥样硬化及心血管疾病的主要危险因素［10］。Ang-Ⅱ的增高会加剧血管狭窄的形成。由此看来，VEGF-A和Ang-Ⅱ都是引起血管再狭窄的重要因子，二者起协同作用。本实验研究显示，模型组大鼠外周血Ang-Ⅱ水平显著高于正常对照组。

抵当汤是《伤寒论》治疗蓄血证的名方，由水蛭、虻虫、桃仁、酒大黄组成，具有破血下瘀的功效，现多用于糖尿病瘀血阻滞引起的各种病症。研究表明，抵当汤改良方（由抵当汤去虻虫、桃仁加肉桂组成）具有较好的抗实验性PTCA术后再狭窄作用，其疗效优于血府逐瘀口服液［11］。研究显示，冠心病介入治疗后患者的血瘀状态与再狭窄的发生密切相关，合并中医兼证的不同对再狭窄的发生率无明显的影响，提示血瘀可能是再狭窄发生过程的主要环节［12］。抵当汤中水蛭、虻虫均具有破血通经、逐瘀消癥的作用。实验研究表明，水蛭水煎剂能降脂溶栓，重组水蛭素可显著减轻兔髂总动脉球囊扩张术后新生内膜增殖和管腔狭窄［13］；虻虫具有较强的抗凝血酶作用，能活化纤溶系统；桃仁活血祛瘀，大黄既能通腑泻热，又善活血祛瘀。抵当汤原方的活血化瘀作用远大于抵当汤改良方，其防治PCI术后再狭窄的疗效将会远大于改良方。临床应用表明，抵当汤治疗冠心病心绞痛及PCI术后再狭窄有较好疗效。本实验结果表明，抵当汤可显著降低模型大鼠血清VEGF-A、Ang-Ⅱ水平。抵当汤在显著降低VEGF-A水平从而有效抑制内膜组织增生的同时，降低Ang-Ⅱ水平继而解除缩血管作用，是其防治再狭窄的重要机制之一。