紫金颗粒中黄芩苷和绿原酸的含量测定研究

孙玉滨 赵昱玮 杨 航 高 娜 韩 威 王艳艳 刘秀华▲

1.吉林天药本草堂制药有限公司，吉林长春 130012；2.吉林省吉测检测技术有限公司，吉林长春 130117

紫金颗粒由水牛角、黄芩、金银花、紫草、牡丹皮、赤芍、苦参、地黄、仙鹤草、玄参、蝉蜕等11味药组成，该方由《小品方》中“犀角地黄汤（芍药地黄汤）”化裁而来，组方合理，具有清热解毒，凉血散瘀,用于过敏性紫癜[1-3]。为了更好地控制该药品的质量，保证该药的临床用药安全，本文采用高效液相色谱法对紫金颗粒中的黄芩苷、绿原酸进行含量测定。所建立的方法可靠、准确、专属性强，可作为紫金颗粒的质量控制方法。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（岛津2010型），紫外检测器，高效液相色谱仪（岛津2030型），PDA检测器；KQ-250型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BS210S电子天平（赛多利斯）；黄芩苷对照品，绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为：110715-200514，110753-200413）； 紫 金 颗 粒（20160504，20160505，20160507，吉林天药本草堂制药有限公司）。甲醇（色谱纯），娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 含量测定[5-8]

2.1 黄芩苷含量测定

2.1.1 色谱条件 Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（52∶48）；流速1.0mL/min；检测波长280nm；进样量10μL，等梯度洗脱，理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500，色谱见图1。

图1 高效液相色谱图

表1 黄芩苷回收率测定结果（n=6）

2.1.2 供试品溶液的制备 取紫金颗粒，研细，称取粉末约0.2g，精密称定，置100mL容量瓶中，加70%乙醇约70mL，密塞，超声提取（功率250W，频率35kHz）30min，放冷，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 对照品溶液的配制 取在60℃减压干燥4个小时的黄芩苷对照品6.04mg于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻线，摇匀，即得。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 取缺少黄芩的阴性模拟处方，按工艺方法制备阴性样品，取约0.2g，精密称定，按供试品的制备方法进行制备，得到阴性对照溶液。

2.1.5 线性关系考察 精密称取黄芩苷对照品14.90mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻线，摇匀，精密吸取1mL于10mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻线，得浓度为0.0596mg/mL的对照品溶液。

精密吸取0.0596mg/mL的对照品溶液4、8、12、16、20、24μL注入液相色谱仪测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，黄芩苷量为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程，y=3569.7x-12.868，相关系数r=0.9999。（n=6）。实验表明黄芩苷在0.2384～1.4304μg范围内呈良好的线性关系。

2.1.6 重现性试验 精密称取同一批号（20160505）样品6份，按“2.1.2”制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积，计算得黄芩苷的含量，RSD=0.81%（n=6），平均含量为2.63%，表明，此方法重现性良好。

2.1.7 精密度试验 取同一为供试品溶液，重复进样6次，测定黄芩苷峰面积，计算RSD=0.35%（n=6），结果表明，仪器精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 取同一为供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件，分别于 0、2、4、8、12h进样，根据样品溶液的峰面积考察溶液的稳定性，计算RSD=0.96%（n=5），结果表明，供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.1.9 回收率试验 采用加样回收法，称取黄芩苷含量为2.69%的样品6份，精密称定，分别加入2.704mg/mL（精密称取黄芩苷对照品27.04mg于10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。黄芩苷对照品溶液1mL，按2.1.2项下供试品制备方法制成供试品溶液，按含量测定项下的方法测定本品的回收率，见表1。

2.1.10 三批样品含量测定 按照含量测定方法，对3批紫金颗粒样品中黄芩苷的含量进行了测定，见表2。

表2 样品中黄芩苷含量测定结果（%）

2.2 绿原酸含量测定

2.2.1 色谱条件 Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（9：91）；流速1.0 mL/min；检测波长327nm；进样量10μL，柱温30℃，等梯度洗脱，理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000，色谱见图2。

图2 高效液相色谱图

表3 绿原酸回收率测定结果（n=6）

2.2.2 供试品溶液的制备 取紫金颗粒，研细，称取粉末约0.5g，精密称定，置50mL容量瓶中，加50%甲醇约45mL，密塞，超声提取（功率250W，频率35kHz）30min，放冷，再用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 对照品溶液的配制 取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中,加50%甲醇制成每1mL含30μg的溶液，即得（10℃以下保存）。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取缺少金银花的阴性模拟处方，按工艺方法制备阴性样品，取约0.5g，精密称定，按供试品的制备方法进行制备，得到阴性对照溶液。

2.2.5 线性关系考察 精密称取绿原酸对照品6.80mg，置50mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻线，摇匀。精密吸取该对照品溶液2mL置10mL量瓶中，再加50%甲醇定容，摇匀，即得浓度为0.0272mg/mL的对照品溶液。分别吸取浓度 为 0.0272mg/mL 的 对 照 品 溶 液 1、2、5、10、15、20、25μL，按上述色谱条件测定，结果见表18。以峰面积为纵坐标，绿原酸含量为横坐标绘制标准曲线，回归方程为y=3077284.2x+652.1，相关系数r=0.9999。结果表明绿原酸在0.0272～0.6800μg范围内线性关系良好。

2.2.6 重现性试验 精密称取同一批号（20160504）样品6份，按“2.2.2”制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，计算得绿原酸的含量，RSD=0.39%（n=6），平均含量为0.24%，表明，此方法重现性良好。

2.2.7 精密度试验 取同一供试品溶液，重复进样6次，测定绿原酸峰面积，计算RSD=0.15%（n=6），结果表明，仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12h进样，根据样品溶液的峰面积考察溶液的稳定性，计算RSD=0.86%（n=5），结果表明，供试品溶液在12h内稳定性良好。2.2.9 回收率试验 采用加样回收法，取绿原酸含量为0.24%的样品6份，精密称定，分别加入0.608mg/mL（精密称取绿原酸对照品6.08mg于10mL量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。）的绿原酸对照品溶液1mL，按2.2.2项下供试品制备方法制成供试品溶液，按含量测定项下的方法测定本品的回收率，见表3。

2.2.10 三批样品含量测定 按照含量测定方法，对3批紫金颗粒样品中绿原酸的含量进行了测定，见表4。

表4 样品中绿原酸含量测定结果

3 小结与讨论

3.1 指标成分的选择

紫金颗粒由水牛角、黄芩、金银花、紫草、牡丹皮、赤芍、苦参、地黄、仙鹤草、玄参、蝉蜕等11味药组成，选择黄芩苷和绿原酸作为指标成分，分别为黄芩和金银花的专属有效成分，且专属性良好。

3.2 检测波长的选择[4]

通过紫外的全扫描可以看出黄芩苷在279nm处有最大的紫外吸收，该波长与《中国药典》2015年版一部黄芩“含量测定”项下规定的检测波长280nm相接近；绿原酸在327nm处有最大吸收，与《中国药典》2015年版一部金银花“含量测定”项下规定的检测波长一致。

3.3 提取方法的选择

据文献报道，常用的黄芩苷、绿原酸提取方法主要有回流法与超声提取法[9-13]，通过比较，超声提取法要优于回流提取法，故本实验采用超声提取法进行样品提取，并对样品的提取时间进行了考察，最终确认选择30min作为提取时间。

3.4 色谱条件的选择[14-15]

分别对黄芩苷、绿原酸的流动相、色谱柱、柱温、流速等进行了考察。最终选择甲醇-0.4%磷酸溶液测定黄芩苷，乙腈-0.4%磷酸溶液测定绿原酸。

3.5 讨论

本文对紫金颗粒进行了黄芩苷和绿原酸的含量测定研究，建立了紫金颗粒中黄芩苷和绿原酸的高效液相测定方法，经方法学考察，测定黄芩苷和绿原酸的方法简单、准确可行、专属性强，为其质量标准的建立提供了依据。