藏鸡肌肉组织中3条新发现miRNA序列的克隆及靶基因预测

李志雄，徐亚欧，林亚秋

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用重点实验室，四川 成都 610041）

藏鸡是青藏高原特有的品种资源，主要生活在青藏高原海拔2200～4400 m的半农半牧区，包括西藏的拉萨、昌都、日喀则中南部以及青海、云南、四川的甘孜、阿坝等地区，经过长期的自然选择和人工驯化，已形成一个适应高原气候、觅食能力强、耐粗饲、人工选择程度很低的原始小型品种[1].藏鸡体型小、生长缓慢，但肉质鲜美、风味独特、营养丰富，且具有较强的高海拔适应性，是发展高原养鸡业不可替代的品种资源[2].

miRNA是一类内源性、长为18～25个核苷酸的单链非编码小分子RNA[3].由具有发夹结构的长约70～90个核苷酸的miRNA前体（pre-miRNA）剪切加工形成.在转录后水平能够与靶基因的特定序列结合，从而发挥其对靶基因的调控作用[4].研究表明miRNA能够参与生物体内多种生物学过程，包括细胞的增值与分化、肌肉与脂肪的发育及形成、新陈代谢、激素的分泌、免疫应答、疾病的发生和肿瘤的形成[5].

目前对藏鸡的研究，主要集中在高海拔环境适应性相关的生理、生化指标及分子机制方面.但对藏鸡肌肉生长发育速度方面的研究还较少，尤其是miRNA对藏鸡肌肉生长发育的调控.本研究利用Stem-loop RT-PCR法克隆了藏鸡肌肉组织中3条新发现不同发育阶段差异表达的miRNA序列，并利用生物信息学预测软件预测其可能的靶基因，从而为进一步研究这3条miRNA序列在调控藏鸡肌肉生长发育过程中的功能奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 藏鸡及样品采集

本试验选取成都益生康健农业有限公司藏鸡养殖基地的3只150日龄健康母藏鸡为试验动物，屠宰前禁食12 h，然后通过放血法屠宰，屠宰后迅速采集肌肉组织.采集的腿肌组织装入无RNA酶的冻存管中，迅速置于液氮中，带回实验室-80℃保存备用.

1.1.2 主要试剂

Trizol购自Invitrogen公司（上海），去基因组污染反转录试剂盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser）和 pMD-19T载体购自 TaKaRa公司（大连），2 ×Taq PCR Master Mix、胶回收试剂盒和DH5α感受态细胞购自天根生化科技有限公司（北京）.

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成

按照Trizol试剂盒说明书提取肌肉组织总RNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量后，利用Nano-Drop ND-2000（Agilent）对RNA的浓度及纯度进行检测.利用去基因组污染反转录试剂盒将得到的RNA去除基因组DNA污染后合成cDNA第一条链，-80℃保存备用.

1.2.2 引物设计与合成

根据Chen等提出的 Stem-loop RT-PCR[6]的方法，结合本实验室之前小RNA测序得到的miR-13＿529、miR-20＿1207 和 miR-24＿1302 的序列，分别设计带有茎环结构的特异性反转录引物和PCR引物（表1）.表中引物均由生工生物工程有限公司（上海）合成.

表1 反转录和克隆引物Table 1 The primer sequences of the stem-loop RT-PCR experiments

1.2.3 miRNA序列的克隆

以自行设计的带有茎环结构的特异性反转录引物代替反转录试剂盒中的通用引物，按照试剂盒说明书，去除基因组DNA污染后，合成cDNA的第一条链.以肌肉组织cDNA为模板，PCR反应体系（15 μL）为 2 × Taq PCR Master Mix 7.5 μL，Forward Primer（10 pmol/ μL） 0.3 μL，Reverse Primer （10 pmol/μL） 0.3 μL，cDNA （50 ng/ μL） 0.5 μL，ddH2O 6.4 μL.PCR 反应条件为 95 °C 4 min；94 °C 30 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s，36 个循环；72 °C 10 min.

PCR产物经电泳分离后，用胶回收试剂盒切胶回收目的条带，然后连接pMD-19T载体，转化DH5α后筛选阳性克隆，送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序.

1.2.4 miRNA序列前体二级结构的预测

结合之前小RNA测序获得的3条miRNA的前体序列，利用RNAfold[7]软件对三条miRNA前体序列的二级结构进行预测.

1.2.5 miRNA序列靶基因的预测

利用靶基因预测软件 TargetScan[8]、miRDB[9]、DIANA-microT[10]和miRanda[11]4个在线软件，预测与3条miRNA序列具有靶标关系的基因，对4个靶基因预测软件得出的结果做韦恩图取其交集，获得较为可信的靶基因[12-13].

2 结果

2.1 藏鸡肌肉组织中3条miRNA序列的克隆

以肌肉组织RNA为模板，利用自行设计的带有茎环结构的特异性反转录引物合成cDNA的第一条链.经过扩增获得藏鸡3条新发现的miRNA序列，分析表明克隆得到miR-13＿529序列23bp，miR-20＿1207序列21bp，miR-24＿1302序列 22bp （图 1）.结合小RNA测序获得的3条miRNA的前体序列，对前体序列的二级结构进行了预测，3条miRNA的前体序列长度均在60 bp左右，并且均具有茎环结构（图2）.

图1 3条新发现miRNA序列的测序图谱A:miR-13＿529；B:miR-20＿1207；C:miR-24＿1302Fig.1 Sequencing chromatogram of 3 newly discovered miRNAs

图2 3条新发现miRNA序列前体的二级结构的预测A:miR-13＿529；B:miR-20＿1207；C:miR-24＿1302Fig.2 Secondary structure prediction for precursors of 3 newly discovered miRNAs

2.2 藏鸡肌肉组织中3条miRNA序列靶基因的预测

利用 TargetScan、miRDB、DIANA-microT 和 mi-Randa在线软件，预测得到与miR-13＿529具有靶标关系的基因分别有53、128、105和509个.做韦恩图取其交集，结果如图3A所示.4个软件共同预测出2个靶基因，分别为 Spermatid perinuclear RNA binding protein（STRBP）基因和 lysine（K）-specific demethylase 2B（KDM2B）基因.与 miR-20＿1207具有靶标关系的基因分别有146、140、168和429个.做韦恩图取其交集，结果如图3B所示.4个软件共同预测出10个靶基因，分别为 Phosphofurin acidic cluster sorting protein 2 （PACS2）基因、H2A histone family，member Z（H2AFZ）基因、Oxysterol binding protein-like 1A（OSBPL1A）基因、Syntabulin （SYBU）基因、Valosin containing protein interacting protein 1（VCPIP1）基因、Member RAS oncogene family 5C （RAB5C）基因、AT rich interactive domain 2 （ARID2）基因、Family with sequence similarity 168，member A （FAM168A）基因、Neuro-oncological ventral antigen 1 （NOVA1）基因和Arginine and glutamate rich 1（ARGLU1）基因 .与miR-24＿1302具有靶标关系的基因分别有21、19、6和31个.做韦恩图取其交集，结果如图3C所示.4个软件没有预测出共同靶基因，miRDB、DIANA-microT和miRanda 3个软件共同预测出1个靶基因，为Overexpressed in colon carcinoma 1 protein homolog （OCC-1）基因.

图3 TargetScan、miRDB、DIANA-microT和miRanda软件预测的3条新发现miRNA序列的靶基因的数量A:miR-13＿529；B:miR-20＿1207；C:miR-24＿1302Fig.3 The amount of target genes predicted by TargetScan，miRDB，DIANA-microT and miRanda for 3 newly discovered miRNAs

3 讨论

作为青藏高原特有的原始品种，藏鸡肉质鲜美，具有丰富的营养价值，并以区别于普通肉鸡的半野生生活模式受到市场的青睐，市场价格较普通肉鸡也高出很多.藏鸡耐粗饲放养，抗病力强，对青藏高原的恶劣气候和生态环境有很好的适应能力，但是藏鸡体型小，生长缓慢，通常需要150～180天的生长周期，成为制约藏鸡养殖的主要因素[14].

本研究通过Stem-loop RT-PCR克隆测序得到的3条miRNA序列的长度分别为23bp、21bp和22bp，长度满足miRNA序列的基本特征，同时3条miRNA序列前体序列的二级结构经预测均具有茎环结构，满足miRNA前体具有茎环结构的基本特征.

为了进一步研究3条miRNA序列miR-13＿529、miR-20＿1207和miR-24＿1302在藏鸡肌肉发育过程中的作用，对3条miRNA序列的靶基因进行了预测.miR-13＿529的靶基因STRBP可以调控肌肉细胞的生长，KDM2B基因则可以通过与核糖体RNA转录区域结合抑制其转录，促进肌肉细胞的增殖和发育[15].miR-20＿1207的 10个靶基因中，PACS2基因[16]、VCPIP1[17]基因、ARID2[18]基因则分别与细胞调亡、细胞有丝分裂以及细胞的增殖和迁移相关.miR-24＿1302的靶基因OCC-1也被证明在肌肉组织中具有较高的表达水平[19].综上所述，3条miRNA序列预测得到的靶基因在细胞的增殖、发育、有丝分裂和凋亡的过程中均具有一定的作用，表明这3条miRNA序列可以与其靶基因结合从而调控藏鸡肌肉的生长发育.

4 结论

本研究成功克隆得到藏鸡肌肉组织中3条新发现的 miRNA序列，长度分别为 miR-13＿529序列23bp，miR-20＿1207 序列 21bp，miR-24＿1302 序列22bp，并对其前体的二级结构进行了预测.利用4个靶基因预测软件共同预测出3条miRNA序列可能的靶基因.本研究为进一步探讨3条新发现miRNA序列在调控藏鸡肌肉发育中的作用奠定了基础.