除翳解毒方对复发单纯疱疹病毒性角膜炎大鼠模型血清CD4+、CD8+T细胞的影响

程 娟，李 琦，张 红，宋宙光，王 丽，李翠红，夏静萍，任丽红

单纯疱疹性病毒性角膜炎 （herpessimplex keratitis,HSK）由单纯疱疹病毒 （herpes simplex virus,HSV）感染，免疫与炎症反应参与，损伤角膜及眼表组织结构的复杂性眼病[1]。由于抗生素和皮质类激素的不合理应用，其发病率有上升趋势。HSK为最常见的角膜病，在角膜病中致盲率占第一位。病情反复发作是此病的特点，且多次发作后会出现角膜混浊逐渐加重，最终导致失明[2]。

当机体免疫力下降时，潜伏的病毒激活，沿三叉神经逆行至靶组织，引起发病。西药治疗该病虽然有一定疗效，但长期应用容易产生抗药性；另外，滴眼液中防腐剂对眼表长期的刺激会影响泪膜功能，导致泪液相对缺失，使角膜失润抵御功能下降，故本病病程长、易复发。中药抗病毒的优越性在于：辨证用药，随症加减，调节全身，综合治疗；中药抑制杀灭病毒作用强，不产生耐药性，且不易复发[3]。笔者采用除翳解毒方治疗HSK，经过长期临床研究发现，除翳解毒方不仅能缩短病程，促进疾病痊愈，而且可以减少复发率。为进一步探讨该方抗HSK复发的免疫学机制，本实验使用该方干预复发HSK大鼠模型，观察其对血清CD4+、CD8+T细胞及其比值的影响，从细胞免疫水平探讨除翳解毒方对HSK的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物：选用SPF级SD大鼠80只，雌雄各半，体重250～260 g，裂隙灯显微镜、眼底镜检查均无异常，山西医科大学实验室提供，实验动物许可证号：SCXK(晋)2013-0002。 实验室温度 20℃，湿度 50°，适应性饲养1 w。

1.1.2 主要药品及试剂：更昔洛韦眼用凝胶（湖北科益药业股份有限公司），生产批号：H20050406；除翳解毒方：黄芪、金银花各15 g、连翘、蒲公英、赤芍、生地黄、黄芩、秦皮、板蓝根、木贼、蝉蜕、谷精草各10 g，由山西省眼科医院药剂科提供；荧光素钠注射液（广州白云山明兴制药有限公司），批号：120602；HSV-1毒株 （由武汉大学医学病毒研究所提供），由山西省疾病预防控制中心复制扩增病毒，分装冻存管后保存于-70℃冰箱备用；DAB显色剂（上海源叶生物工程有限公司）；CD4/CD8检测试剂盒 （贝克曼库尔特商贸有限公司）；单纯疱疹病毒1型（HSV-1）核酸检测试剂盒(荧光PCR法，硕世生物科技股份有限公司)。

1.1.3 主要仪器设备：YZ5FI数码裂隙灯（苏州六六视觉科技股份有限公司）；DYY-6 PCR电泳仪（北京市 六 一 仪 器 厂 ）；Beckman-coulter，cytomic FC 7500(USA)流式细胞仪；SJC-Ⅱ型紫外线灯（北京市海淀空后高温复合材料厂）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组：将80只SD大鼠，随机分为正常组、模型组、中西药治疗组、西药对照组，每组20只。

1.2.2 HSK原发感染大鼠模型制备及判定标准：每组大鼠用10%水合氯醛 （0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，裂隙灯下1 ml注射器针头在右眼角膜表面行“井”字划痕，滴加单纯疱疹病毒液20μl，闭眼按摩大鼠右眼睑20 s。造模后1 w内每日行裂隙灯检查、角膜荧光素钠染色，观察角膜是否出现病灶，角膜呈现点状、树枝状、地图状角膜炎且泪液测试阳性的大鼠被判定为原发感染模型建立。

1.2.3 病毒分离及鉴定：病毒分离，泪液测试标本接种人横纹肌肉瘤细胞 （RD）和人喉癌上皮细胞（Hep-2），置于 36 ℃、5%CO2培养箱，连续培养 7 d，逐日观察并记录细胞病变，每份标本在2种细胞上至少传2代，如不出现致细胞病变效应（Cytopathic Effect，CPE），则判为阴性标本；如果出现了疱疹病毒特异的CPE，待CPE达到+++及以上收集细胞，提取病毒核酸，按荧光PCR方法进一步鉴定，毒株保种。病毒鉴定，采用PCR方法，利用实时定量PCR仪，使用单纯疱疹病毒（HSV）核酸、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）核酸检测试剂盒(荧光 PCR法)进行检测，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 干预方法：选取造模成功大鼠，分为中西药治疗组、西药对照组、模型组。中西药治疗组给予除翳解毒方灌胃，bid，更昔洛韦眼凝胶，tid，点眼治疗；西药对照组给予更昔洛韦眼凝胶，tid，点眼治疗。行裂隙灯显微镜检查、角膜荧光素钠染色、眼前节照相，biw，记录病情变化。

1.2.5 除翳解毒方制备：黄芪、金银花各15 g、连翘、蒲公英、赤芍、生地黄、黄芩、秦皮、板蓝根、木贼、蝉蜕、谷精草各10 g,一煎加水 910 ml，浸泡 30 min，煮沸后再文火慢煎20 min，二煎加水390 ml，煮沸后，文火慢煎10 min，合并滤液共1000 ml，95℃水浴浓缩至250 mL，浓度为5.2 g/ml，灌胃,按每100 g体重1 ml计算喂药量，bid，置4℃冰箱储存备用。

1.2.6 复发感染大鼠模型制备及判定标准：6 w后自制大鼠固定器，暴露头部，置于波长为311 nm的紫外线B光下照射大鼠右眼180 s建立复发感染模型。每日裂隙灯检查、角膜荧光素钠染色观察角膜是否出现病灶，泪液分泌试纸收集泪液PCR法检测HSV-1，确定造模是否成功。

1.2.7 观察 第10 w末，行裂隙灯显微镜检查、眼前节照相、泪液细胞培养PCR检测HSV-I，之后处死全部大鼠，行角膜组织氯化金染色检测角膜内神经纤维，流式细胞仪检测CD4+、CD8+T细胞及其比值。（1）角膜神经组织氯化金染色观察，取角膜组织，按以下步骤处理：在质量分数为15%的柠檬酸中放置15 min；置于质量分数为l%的氯化金溶液中1 h；置于酸水中5 h(酸水配制为每100 ml蒸馏水加6滴冰醋酸)；乙醇梯度脱水；铺片、中性树胶封片。光镜下观察，拍照。（2）流式细胞仪检测CD4+、CD8+T细胞、CD4+/CD8+的测定：取大鼠腹主动脉血1 ml测定T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+T细胞百分比及CD4+/CD8+的比值，采用单克隆抗体碱性磷酸酶法，选用美国贝克曼公司流式细胞仪及该公司提供的试剂盒，按说明书要求的操作程序严格操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件分析，计量数据均采用均数±标准差表示，计量资料使用 t检验，计数资料使用卡方检验、方差分析和多个样本均数两两比较的SNK检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裂隙灯显微镜检查、眼前节照相

造模第2、3 d大鼠角膜陆续开始出现水肿、混浊，角膜荧光素钠染色呈点状、地图状（见图1）。

2.2 氯化金染色检测角膜神经纤维

氯化金染色后，光镜下神经纤维和末梢呈黑色。正常组大鼠角膜神经纤维丰富，轴突末梢形成网络状结构；模型组大鼠角膜周边纤维束更细，纤维变稀疏，部分纤维变短，角膜中央失去网络状分布特点；中西药治疗组大鼠角膜周边及中央神经纤维较丰富，轴突末梢大致呈网络结构；西药治疗组大鼠角膜周边神经束纤维变细，分支减少（见图2）。

2.3 流式细胞仪检测CD4+、CD8+，CD4+/CD8+T细胞

模型组与正常组比较CD4+T细胞减少，CD8+T细胞增加，CD4+/CD8+T降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；中西药组、西药组与模型组比较CD4+T细胞增加，CD8+T细胞减少，CD4+/CD8+T升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；中西药组与西药组比较CD4+T细胞增多，CD8+T细胞减少，CD4+/CD8+升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

图1 HSK大鼠模型裂隙灯图。1A造模前；1B造模后；1C造模后角膜点状染色图；1D造模后角膜地图状染色。HSK：单纯疱疹性病毒性角膜炎

图2 光镜下检测各组氯化金染色角膜神经纤维。2A正常组；2B模型组；2C中西药组；2D西药组

表1 4 组大鼠 CD4、CD8、CD4/CD8 比较

表1 4 组大鼠 CD4、CD8、CD4/CD8 比较

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与西药组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

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3 讨论

单纯疱疹病毒性角膜炎是严重危害视觉健康的眼部感染性疾病，其发病机制与免疫调节系统紊乱有密切关系。HSK反复发作的原因为机体抵抗力下降，潜伏在机体的HSV再次活化并逆行到眼表或角膜的上皮细胞[4]。Young等[5]报道初次感染HSV患者l、5、10、20 年复发率分别为 27%、50%、57%、63%，有复发史者复发率则更高。虽然西药如阿昔洛韦、更昔洛韦滴眼液，更昔洛韦胶囊、干扰素、聚肌胞注射液等在抗病毒方面疗效肯定，但是在调节免疫功能和预防HSK复发方面效果却不尽人意。

CD4+调节性T细胞在控制HSK的发生发展中起重要作用，缺乏调节性T细胞可使角膜感染加重，且低剂量的病毒即可致病。CD8+T细胞虽然在HSK的免疫应答中并不占主导地位，但在CD4+T细胞缺乏时，HSV可刺激CD8+T细胞起到短暂的免疫反应替代作用[6]。CD4+T细胞减少导致机体细胞免疫功能和抗病毒能力降低。CD8+T细胞具有抑制体液免疫以及抗病毒等免疫功能，血中CD8+T细胞水平升高意味着抑制性T细胞和杀伤性T细胞的平衡失调，也是导致HSK发生和复发的原因之一。CD4+/CD8+值在一定程度上反映了机体的细胞免疫状态[7]。

该病归属于《证治准绳·杂病·七窍门》中“聚星障”及“花翳白陷”的范畴。书中认为毒“入里化热、外邪犯目”所致“肝经伏火，复受风邪，上攻黑睛”[8]。陈子燕等[9]指出本病的病因为伏邪内伤，病机为气虚邪留，邪热内伏，治疗上以益气解毒为主。临床实验证明多种益气驱邪类中药均为免疫促进剂，能增强单核吞噬细胞系统吞噬功能，诱生干扰素，促进淋巴细胞转化，提高淋巴细胞免疫水平[10]。

HSK系机体正虚的基础上，风热邪毒乘袭，聚积于目，上扰风轮而致黑睛云翳，畏光流泪等，久则气虚渐甚，邪热内伏，演变为正虚邪恋，反复发作，常伴体虚乏力。运用益气解毒类中药既可以提高病毒性角膜炎的临床疗效，又可以避免耐药性的产生，同时还能积极防止疾病复发，多种功效相集，具有一定的临床意义。

通过对中医文献的研究及临床实践，以益气养阴、退翳明目为法，笔者自拟除翳解毒方经过长期的临床观察，证实能减轻角膜病损，缩短病程，降低复发率，其作用在于既能清热解毒以祛邪治标，又能益气固表以扶本护目。方中黄芪、生地黄益气养阴、扶正固表；金银花、连翘祛风清热；蒲公英、板蓝根、黄芩、秦皮清热燥湿解毒、木贼、蝉蜕、谷精草疏散风热、明目退翳共为臣药；赤芍清泻肝火、泻血分郁热，增强了本方清热解毒的功效，诸药合用，融攻补为一方，共奏益气养阴、疏风清热、退翳明目之功。临床用除翳解毒方祛邪与扶正同施，标本兼治，对防止该病复发有较好的疗效，充分体现了中医药“祛邪扶正”防治HSK复发的学术观点。

本实验结果表明应用除翳解毒方能够明显增加CD4+T细胞数量，提高CD4+/CD8+比值，并在一定程度上减少CD8+T细胞数量，故认为除翳解毒方对复发性HSK大鼠模型引起的免疫紊乱有纠正作用，能够加快大鼠免疫功能的恢复，从而增强机体抵抗病毒入侵或抑制潜伏病毒活化、复制的能力，促进疾病愈合，这可能是除翳解毒方预防复发的机制之一。研究结果也提示在临床中治疗HSK患者，不但应重视单纯抗病毒药在急性期达到临床痊愈治疗目的，更应该重视在病程中对全身免疫状态的调节以及临床治愈后潜伏期的持续治疗，尤其是增强免疫功能的治疗。