密蒙花方防治高糖下体外视网膜神经节细胞损伤机制探讨

吴正正 ，严 华 ，葛东宇 ，王 谦 ，严 京 ，宫喜梅 ，宋小花

糖尿病视网膜病变 (diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常见和严重的眼部并发症之一，目前占双眼盲病因的第一位。长期以来，视网膜微血管病变被认为是诊断DR的金标准，然而，越来越多的研究表明，视网膜神经节细胞的功能异常出现在DR微血管病变之前，这一认识对于如何早期防治DR具有重要意义。本课题组总结多年临床经验，提出“心肾论治”DR的新思路，并在此指导下创立密蒙花方，用于治疗早期DR取得良好临床疗效。现通过离体细胞试验，从检测视网膜神经节细胞凋亡情况，Real Time-PCR法及Western blot法检测视RGC-5内神经营养因子mRNA及蛋白水平和从Sigma-1R机制方面探讨密蒙花方防治DR早期视网膜神经损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：RPMI1640培养基、DMEM培养基 （美国Gibo公司），胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶-0.02%EDTA，PBS粉，1%青链霉素双抗，谷氨酰胺，HEPES(北京泰格美公司)，Cell Conting Kit-8 试剂盒（碧云天），4%多聚甲醛（中国医学科学院生物研究所）Annexin V-FITC/PI试剂盒 （嘉美生物有限公司）。 DNase I，RNase Inhibitor，美国 Fermentas（MBI）公司，dNTP(10 mM)2 Ex TaqMix，DL2000 分子量标准，宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖，西班牙Biowest公司；RNase-free H2O，韩国Walgene公司。Sigma-1R、BDNF、CNTF的引物序列由北京擎科生物工程有限公司合成.

1.1.2 细胞株：小鼠视网膜神经节细胞株RGC-5购自上海瑞鹿生物科技有限公司

1.1.3 中药：购自北京燕北药材公司，经我院中药房鉴定为所用道地药材。生黄芪（产于内蒙古），女贞子、益母草（均产于河北），黄连（产于四川），肉桂（产于广东），密蒙花（产于湖北）。

1.1.4 仪器：二氧化碳培养箱（美国NAPCO公司），超净工作台 （北京月坛仪器厂），倒置相差显微镜(COIC,XDS-1,重庆光学仪器厂)，全自动酶标仪（意大利 SEAC 公司），流式细胞仪（BDFACSCalibur，美国BD公司），低温冰箱（日本SANYO），干燥箱（日本 SANYO），Chromo4荧光定量 PCR仪，美国BIO-RAD公司，电泳槽，日本TAKARA公司；image system(EUV-LDUV)凝胶成像系统，韩国Korea Biotech公司。

1.2 药物配制及分组

1.2.1 中药水煎剂的制备 密蒙花方组成：生黄芪、密蒙花、黄连、肉桂、乌梅、女贞子、益母草，将中药方浸泡30 min，武火煮沸，文火煎15 min，煎两次，过滤去渣合并液体，浓缩为每付100 ml，药物浓度为0.82 g/ml,4℃冰箱保存备用。

1.2.2 含药血清的配制 成年大鼠60只，体重为200 g左右，随机分2组，正常组10只，中药组50只。中药组每日灌胃密蒙花方水煎剂7.38 g/Kg·d，按单位体重等效计量换算，相当于人的6.3倍。空白对照组每次灌胃等容量体积的生理盐水，连续给药5 d，bid，禁食12 h，末次给药1 h后腹主动脉取血，3000 r/min离心 10 min，56℃灭活 30 min，0.22 um过滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存备用保存备用。

1.2.3 实验分组：（1）正常组：正常培养的RGC-5细胞；（2）模型组：高糖条件下培养 RGC-5 细胞；（3）密蒙花方12 h组：高糖+密蒙花方含药血清；（4）密蒙花方24 h组：高糖+密蒙花方含药血清；（5）密蒙花方36 h组:高糖+密蒙花方含药血清。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8法检测密蒙花方含药血清对高糖状态下RGC-5细胞增殖的影响：取生长良好，长满融合的视网膜神经节细胞，消化制成细胞悬液，调整细胞密度2000个/ml。将细胞悬液均匀接种于96孔板中，每孔100ul。常规培养24h后，以无血清RPMI1640继续培养24 h，使细胞同步化。根据实验分组分别加入不同药物，每组设6个复孔，分别培养12 h、24 h、36 h、48 h、72 h。每孔加入 CCK-8 溶液 10 ul，37℃,5%CO2培养箱内孵育1h。全自动酶标仪上用450 nm波长比色测定，测出每孔吸光度 （optical density）A值，记录结果。增殖率=（实验组平均A值-对照组平均A值）/对照组平均A值×100%。抑制率=（对照组平均A值-实验组平均A值）/对照组平均A值×100%。

1.3.2 FCM检测密蒙花方含药血清对高糖状态下RGC-5细胞凋亡的影响：⑴将细胞接种于50ml培养瓶中，根据上述实验分组加入不同药物，分别于培养12 h、24 h、36 h后消化收集细胞。⑵将预冷的70%乙醇沿壁缘滴入，轻轻吹打细胞，4℃固定12 h以上。⑶ 离心（1000 r/min，4 min），PBS 洗 2 次，弃上清。⑷加入浓度为1 mg/ml RNaseA 30μl，37℃恒温水浴锅中孵育30 min。⑸加入PI染色液800μl，4℃避光30 min。⑹FCM测定DNA含量，所有资料经ModfitV3.0软件分析。

1.3.3 Realtime PCR法检测检测RGC-5细胞内Sigma-1R、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）、睫状神经营养因子（Ciliary Neurotrophic Factor，CNTF）mRNA 表达水平：取视网膜组织，迅速转移至预冷的RNAiso Plus试剂中匀浆，常规提取组织总RNA，待RNA沉淀完全，加适量无RNA酶的无菌水溶解后于-80℃保存。酶标仪紫外分光光度法鉴定RNA纯度。PrimeScript RT reagent Kit进行基因组DNA的除去反应、逆转录反应。按PCR反应体系进行扩增和检测。

1.3.4 Western blot法检测检测RGC-5细胞内Sigma-1R,BDNF，CNTF蛋白表达水平:蛋白样品制备，提取细胞内总蛋白，配好胶后蛋白上样，电泳，转膜后封闭，加一抗，用封闭液将一抗1：400稀释)，洗膜，结合二抗(辣根过氧化物酶1：3000稀释)，洗膜3次。在暗室中采用增强化学发光法检测目的条带，曝光适当时间，经显影、定影后室温下晾干。采用图像扫描，灰度分析。以 Sigma-1R,BDNF，CNTF与β-actin的光密度比值表示 Sigma-1R，BDNF，CNTF蛋白的表达。

表1 Sigma-1R,BDNF,CNTF的引物序列

图1 倒置显微镜下视网膜神经节细胞RGC-5形态，1A 正常组；1B 高糖组；1C 中药组

1.4 统计学分析

应用SPSS13.0统计软件分析。所有结果用均数±标准差）来表示。各组间数据比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），若 P＜0.05 则表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RGC-5细胞形态学变化

倒置显微镜下，视网膜神经节细胞接种于无血清的神经基质培养基，3 h见细胞有突起长出，细胞近似圆形;细胞形态均一，24 h开始有突触生长，细胞逐渐延长并增粗，相差显微镜下突起明显可见，72h突触增多并伸长，细胞体较大，细胞突起较长，突起的长度可达细胞体直径的数倍，细胞间可见突起相互连接。高糖组细胞在高糖状态下细胞生长受到抑制，细胞间隙增大，部分区域脱落，可见部分死细胞。中药组细胞增殖旺盛（见图1）。

2.2 密蒙花方对高糖状态下RGC-5细胞增殖的影响

经CCK-8法检测，密蒙花方含药血清作用于高糖状态下 RGC-5 细胞，12 h、24 h、36 h 后，密蒙花方均显示出促进高糖状态下RGC-5细胞增殖的作用，并且呈浓度依赖关系。

与正常组比较，高糖组吸光度值降低（P＜0.01），表现出有抑制RGC-5增殖的作用，与高糖组比较，中药组吸光度值升高（P＜0.01），表现出有促进RGC-5增殖的作用。

2.3 密蒙花方对高糖状态下体外RGC-5细胞凋亡的影响

与正常组比较，高糖组RGC-5细胞凋亡率增高，说明高糖状态下视网膜神经节细胞受到损伤，增殖受到抑制。与高糖组比较，中药组RGC-5细胞凋亡率降低，说明密蒙花方具有保护视网膜神经节细胞RGC-5细胞免受损伤，减少细胞凋亡的作用，此作用分别在12 h，24 h，36 h均有体现，具有统计学意义（P＜0.01）,见表 2。

表1 CCK8法检测密蒙花方对RGC-5细胞增殖的影响

表1 CCK8法检测密蒙花方对RGC-5细胞增殖的影响

注：** 与正常组比较，P＜0.01

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表2 FCM检测密蒙花方对RGC-5细胞凋亡的影响

表2 FCM检测密蒙花方对RGC-5细胞凋亡的影响

注：**中药组与高糖组比较，P＜0.01

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2.4 密蒙花方对 RGC-5细胞 Sigma-1R、BDNF、CNTF的mRNA含量的影响

对RGC-5 BDNF mRNA表达的影响：与正常组相比，高糖组BDNFmRNA表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与高糖组相比，密蒙花方含药血清组 BDNF mRNA表达增加，12 h时和 36 h BDNF mRNA表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；24 h时BDNFmRNA表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。 （见表 3）

表3 密蒙花方对RGC-5细胞BDNFmRNA表达的影响

表3 密蒙花方对RGC-5细胞BDNFmRNA表达的影响

注：★★高糖组与正常组比较P＜0.01；▲中药组与高糖组比较，P＜0.05，▲▲中药组与高糖组比较，P＜0.01

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密蒙花方对RGC-5细胞CNTF mRNA表达的影响：与正常组相比，高糖组CNTFmRNA表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与高糖组相比，中药组CNTF mRNA表达增加，随时间延长mRNA表达逐渐增加，12 h时与高糖组没有统计学意义，24 h时差异具有统计学意义 （P＜0.05）；36h时CNTF mRNA表达增高明显差，异具有统计学意义（P＜0.01）。 （见表 4）

表4 中药组对高糖状态下RGC-5细胞CNTF mRNA表达的影响

表4 中药组对高糖状态下RGC-5细胞CNTF mRNA表达的影响

注：★★高糖组与正常组比较P＜0.01；▲中药组与高糖组比较，P＜0.05，▲▲中药组与高糖组比较，P＜0.01

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密蒙花方对RGC-5细胞Sigma-1R mRNA表达的影响：与正常组相比，高糖组Sigma-1R mRNA表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与高糖组相比，中药组Sigma-1RmRNA表达增加，在12 h和24 h时增加 （P＜0.01）；36 h时表达升高没有统计学意义。（见表5）

表5 中药组对高糖状态下RGC-5细胞Sigma-1RmRNA表达的影响

表5 中药组对高糖状态下RGC-5细胞Sigma-1RmRNA表达的影响

注：★★高糖组与正常组比较P＜0.01；▲中药组与高糖组比较，P＜0.05；▲▲ 中药组与高糖组比较，P＜0.01

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2.5 Western blot法检测RGC-5细胞BDNF、CNTF及Sigma-1R蛋白水平

BDNF蛋白表达：高糖组明显低于正常组，且随着时间延长表达量逐渐降低至36 h时最低。中药组与高糖组比较，在12 h时略有升高，在24 h时表达量最高，36 h时降低，但仍明显高于高糖组。（见图3）

CNTF蛋白表达：高糖组明显低于正常组，且随着时间延长逐渐降低，至36 h时最低。中药组与高糖组比较，在12 h时略有升高，在24 h时最高，36 h时降低，其与β-actin的比值仍高于高糖组。

图3 Western blot法检测RGC-5细胞BDNF、CNTF及Sigma-1R蛋白水平。σ1：Sigma-1R

Sigma-1R蛋白表达：高糖组Sigma-1R蛋白表达明显低于正常组，参照与β-actin的比值各时间点未见明显差异。中药组与高糖组比较，在12 h、24 h时表达量升高明显，36 h时表达量降低，其与β-actin的比值仍高于高糖组。

3 讨论

DR的研究重点一直在于微血管病变，近年来的研究表明[1-3],DR神经元的损伤发生在微血管改变之前，因此重视对视网膜神经细胞的防护对于早期DR的防治具有重要意义。本课题组长期采用中医药对DR进行防治，提出“心肾论治早期DR”的新思路，并在此辨证思路的指导下创立密蒙花方，对于早期DR临床上取得良好疗效。密蒙花方是在密蒙花、交泰丸（黄连、肉桂）的基础上加黄芪、女贞子、益母草等药而成。诸药相配，具有益气养阴、和血明目的作用。

视网膜神经节细胞 (retinal ganglion cell，RGC)是视网膜内层的主要组成部分，是视觉器官的第三神经元，其树突在内丛状层，轴突形成轴索穿出眼球进入神经纤维层，构成视神经，由视神经将视网膜神经节细胞感受到的光刺激信息传递至大脑枕叶完成视功能，是具有视网膜视觉信号输出功能的神经元。RGCs进行性死亡是视功能不可逆性损害的主要原因。研究表明，RGCs损伤是糖尿病视网膜病变中的重要环节，保护视网膜神经细胞会延缓糖尿病视网膜病变的发生[1]。

Whitmire W[2]发现DR早期视网膜损伤可表现为：视网膜内层RGCs数目减少，RGCs损害的主要途径是RGCs轴突轴浆运输阻断导致神经营养因子缺乏，造成RGCs的原发性损伤，通过胞内信号转导，激发一系列级联式反应，激活了某些诱导凋亡的基因，最终导致细胞凋亡，进一步引起RGCs的继发性损害。因此补充神经营养因子，对视网膜神经节细胞的凋亡可能有一定的防治作用。动物研究发现，补充脑源性神经生长因子、神经生长因子可减少R GC凋亡［3］。RGCs存活或轴突再生依赖于神经营养因子。其中脑源性神经营养因子（BDNF）、视网膜睫状神经营养因子 (CNTF)在视网膜神经节细胞层和Muller纤维中表达,并且对神经节细胞的生存起重要作用[4-5]。

国内外大量研究证实，体外培养时25～30mmol/L的高糖浓度，可等同于糖尿病时体内高糖状态[6]，本实验结果与此相符。研究采用CCK-8法检测细胞增殖显示高糖组吸光度值显著降低抑制RGC-5增殖（P＜0.01），与高糖组比较，中药组吸光度值显著升高，表现出明显的促进RGC-5增殖的作用，并且呈浓度依赖关系（P＜0.01）。通过流式细胞术检测RGC-5细胞凋亡率证明高糖可诱导GRC-5出现凋亡，且呈时间依赖性。本试验研究通过mRNA和蛋白表达检测，证实睫状神经营养因子和脑源性营养因子水平在高糖下表达下降，而在中药组表达升高。提示密蒙花方含药血清可通过升高细胞内神经生长因子水平，从而起到保护视网膜神经节细胞的作用。

Sigma受体曾被视为阿片类受体的一个亚型，它参与保护神经、影响细胞活性和增殖、调节离子通道等生物学功能。研究表明[7]，Sigma-1R的激活能够抑制谷氨酸兴奋性毒性所致的培养大鼠视网膜神经元的凋亡,其机制可能与抑制NMDAR和AMPAR介导的Ca2+内流，阻止胞内钙超载有关[8]。本研究中糖尿病模型组Sigma-1R蛋白水平降低，中药组与DM模型组相比，Sigma-1R蛋白水平升高，提示密蒙花方能通过调节Sigma-1R参与抑制谷氨酸兴奋性毒性,发挥保护视网膜神经节细胞的作用，有研究提出Sigma-1R与GRP78结合后被激活参与内质网应激[9]。其如何通过内质网途径发挥作用有待进一步研究。

密蒙花方是高健生研究员通过多年临床经验总结出来防治糖尿病视网膜病变有效的方剂，临床观察具有防护早期糖尿病视网膜病变作用[10-11]。本研究中，中药密蒙花方可以上调睫状神经营养因子和脑源性营养因子表达，Sigma-1RmRNA及蛋白水平升高，且体外培养的视网膜神经节细胞凋亡明显减少，进而推断密蒙花方可防治高糖下体外培养的视网膜神经节细胞发生凋亡和损伤，其机制可能与调节神经营养因子BDNF、CNTF表达和Sigma介导有关。