清眩润目饮对蒸发过强型干眼模型鼠角结膜炎症因子表达的影响

王佳娣 ，姚 靖 ，曹丛红 ，于坷鑫

干眼是由于泪液的量或质或流体动力学异常引起的泪膜不稳定和(或)眼表损害，从而导致眼不适症状及视功能障碍的一类疾病[1]。临床将干眼分为五类，以蒸发过强型比例最高，60%以上是由睑板腺功能障碍（MGD）引起，国内资料亦显示干眼患者中85%以上与MGD有关[2]，且患病人群呈现出年轻化、低龄化的特点。国际干眼工作组于2007年明确指出炎症与干眼的发生发展密切相关[3]，眼表组织的免疫性炎症是干眼最本质的病理生理改变。清眩润目饮主要在临床上用于治疗睑板腺功能障碍所致蒸发过强型干眼,并取得良好疗效[4-6]，本实验旨在观察清眩润目饮对蒸发过强型干眼模型鼠角、结膜炎症因子表达的影响，从而探讨该药治疗干眼的机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取18只健康SD大鼠（实验动物生产许可证号：SCXK（黑）2015-003），雌雄不限，体重 20.0±2.0 g/只，经裂隙灯检查眼前节无异常，Schirmer试验＞10 mm/5 min且泪膜破裂时间 （BUT）＞l0 s的动物方可使用。随机分为3组，分别为空白对照组6只（12眼），模型组6只 （12眼），清眩润目饮组6只（12眼）。空白对照组不做任何处理，模型组、清眩润目饮组进行造模。

1.2 主要试剂药品及实验仪器

清眩润目饮（主要药物组成：玄参、麦冬、生地黄、金银花、连翘、防风等），中药按一定比列配伍而成，药物由黑龙江中医药大学附属一院药剂科提供，并由我校制剂室加工成浓度为每1 ml含生药1 g的混悬液，密封，4℃保存备用。75%乙醇、荧光素钠试纸（许可证号：津食药监械生产许20100040）、泪液检测滤纸条 （许可证号：津食药监械生产许2400041）、盐酸奥布卡因滴眼液 （参天制药有限公司，5 ml:20 mg）、电子秤、电子天平、眼科手术显微镜（编号：JX7-130213）、白介素 1β（IL-1β）检测试剂盒（酶联免疫吸附试验法）（SEA563Ra，优尔生公司）、白介素6（IL-6）检测试剂盒（酶联免疫吸附试验法）（SEA079Ra，优尔生公司）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）检测试剂盒 （酶联免疫吸附试验法）（SEA133Ra，优尔生公司）眼科显微手术器械、手持裂隙灯。

1.3 动物模型的制作

33%乌拉坦腹腔注射麻醉，给药剂量为1 g/kg。麻醉满意后按如下顺序进行评分：①睑缘形态；②泪膜破裂时间；③角膜荧光素染色；④Schirmer试验，冷光源下采用改良睑板腺烧灼法，采用纤维电针改良的烧灼器对鼠双眼上下睑缘所有睑板腺口逐一烧灼，时间约为5 s，术后不使用药物涂抹鼠结膜囊，共用7 d，形成蒸发过强型干眼模型。

1.4 实验方法

成功制成干眼模型后，给予清眩润目饮中药灌胃治疗。实验剂量按照成人剂量，根据人鼠/兔体表面积等效换算[7]成实验动物灌胃用药剂量，qd。模型组用生理盐水灌胃，qd。连续灌胃4 w。每2 w测量体质量1次，根据体质量调整给药量。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 蒸发过强型干眼检查：术后第1、2、4 w检查睑缘形态、荧光素染色、Schirmer试验、泪膜破裂时间。3组动物均由同一个人检查，每次检查时间、地点、照明亮度、湿度及温度确保相同，检测各组模型鼠睑缘形态、Schirmer实验、泪膜破裂时间(BUT)和荧光素染色。裂隙灯下观察模型鼠睑缘形态是否规整、有无充血、睑板腺开口有无堵塞、MarX线有无移位等内容。Schirmer实验[8]：将滤纸条前端5 mm反折成直角，夹在实验鼠下睑外侧结膜囊内，5 min后取出滤纸条，2 min后观察并记录滤纸条的湿长，滤纸湿润长度＜10 mm/5 min为异常。泪膜破裂时间[8]：结膜囊滴入荧光素溶液，使鼠被动眨眼数次，一人固定实验鼠同时双手撑开眼睑，一人在手持裂隙灯钴蓝光下用宽裂隙光带观察，记录从最后一次瞬目至角膜出现第一个黑斑即干燥斑的时间，BUT＜10 s为异常。角膜荧光素染色：一人固定实验鼠，一人将荧光素钠溶液滴入鼠眼结膜囊内，瞬目后，在裂隙灯钴蓝光下观察，观察角膜上皮完整性。

1.5.2 标本采集及病理分析：给药4 w后3组实验鼠均以断头法处死，取双眼角膜、结膜组织，小部分以4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋，经过角、结膜间断连续切片，行HE染色，用光镜观察角、结膜组织病理学改变。

1.5.3 角、结膜炎性因子水平及相关蛋白含量测定：按照 TNF-α、IL-1β、IL-6试剂盒说明书步骤，收集各组实验鼠眼表组织液，室温下在相应孔中加入相应浓度的标准品和标本，37℃下避光温育30 min；洗涤5次；在相应孔中加入50μl酶标试剂，密封避光，37℃下温育30 min；洗涤5次；每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，避光37℃下显色15min；每孔加入50μl终止液，用酶联免疫检测仪在波长450 nm处测量各孔吸光度（OD）值，计算出相应兔眼表中 TNF-α、IL-1β、IL-6浓度含量。 利用Western Blot检测角、结膜上皮中TLR4、MyD88蛋白质表达。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 各组大鼠干眼相关检测指标的变化

模型组大鼠BUT较空白对照组大鼠明显缩短，差异有统计学意义（P=0.000）,说明模型复制成功；清眩润目饮组较模型组BUT延长，差异性显著（P=0.000），说明清眩润目饮可有效缩短泪膜破裂时间；清眩润目饮组较空白对照组（P=0.067），无统计学意义。模型组SIT与空白对照组相比，有显著性差异（P=0.000），说明模型复制成功；清眩润目饮组与模型组相比，差异性显著（P=0.000），说明清眩润目饮有效果；清眩润目饮组与空白对照组比较（P=0.075），差异无统计学意义。空白对照组角膜荧光素染色评分与模型组比较差异有统计学意义（P=0.000），说明模型复制成功；清眩润目饮组与模型组比较，角膜荧光素染色评分降低，差异有统计学意义（P=0.000），说明清眩润目饮可减少角膜表面损伤；清眩润目饮组与正常对照组（P=0.076），差异无统计学意义。

2.2 各组大鼠角膜、结膜组织病理学表现

苏木精-伊红染色显示，空白对照组角膜由2～3层鳞状上皮细胞构成，细胞排列整齐均匀；结膜由2～7层非角化鳞状上皮细胞组成，细胞形态规则、完整，结膜表面平滑，可见散在分布的杯状细胞。模型组大鼠角膜、结膜上皮出现缺损，可见炎性细胞浸润，角膜上皮细胞形态异常，角膜基质层水肿，结膜上皮杯状细胞明显减少。清眩润目饮组大鼠角膜、结膜上皮损伤恢复，细胞层数及细胞形态接近正常，部分组织仍可见上皮表面不连续，杯状细胞较模型组增多，偶见炎性细胞浸润(见图1)。

表1 各组大鼠BUT、Sit及角膜荧光素染色评分的比较

表1 各组大鼠BUT、Sit及角膜荧光素染色评分的比较

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.3 各组大鼠结膜组织炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量比较

图1 各组大鼠角膜、结膜组织形态学表现（HE 染色 ×200），空白对照组大鼠角膜、结膜上皮完整，散在分布杯状细胞；模型对照组大鼠结膜上皮缺损，角膜上皮不光滑；清眩润目饮组角膜上皮层基本完整，结膜上皮细胞呈增生状。

IL-1β：模型组大鼠较空白对照组大鼠数值明显升高，差异有统计学意义（P=0.000）；清眩润目饮组较模型组IL-1β降低，差异有统计学意义 （P=0.000）；清眩润目饮组与正常对照组比较，差异无统计学意义（P=0.061）。

IL-6：模型组与空白对照组数值明显升高，差异有统计学意义（P=0.000）；清眩润目饮组与模型组比较，IL-6的值降低，差异有统计学意义（P=0.000）；清眩润目饮组与空白对照组比较（P=0.097），差异无统计学意义。

TNF-α：模型组与空白对照组相比数值明显升高，差异有统计学意义（P=0.000）；清眩润目饮组与模型组比较TNF-α的值降低，差异有统计学意义（P=0.000）；清眩润目饮组与空白对照组（P=0.076），差异无统计学意义。清眩润目饮可有效降低大鼠结膜组织中细胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量，与模型组对比差异具有统计学意义（P=0.000），与正常对照组比较，差异不具统计学意义。

表2 各组大鼠结膜组织炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量比较

表2 各组大鼠结膜组织炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量比较

注：**与空白组比较，P＜0.01；##清眩润目饮组与模型组比较，P＜0.01

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2.4 各组大鼠结膜组织TLR4和MyD88蛋白表达量比较

TLR4蛋白：模型组大鼠较空白对照组大鼠数值明显升高，差异有统计学意义（P=0.000）；清眩润目饮组较模型组降低，差异有统计学意义（P=0.000）。

MyD88蛋白：模型组与空白对照组相比数值明显升高，差异有统计学意义（P=0.000）；清眩润目饮组与模型组比较，MyD88蛋白降低，差异有统计学意义（P=0.000）。

表3 各组大鼠结膜组织中TLR4和MyD88蛋白表达量的比较

表3 各组大鼠结膜组织中TLR4和MyD88蛋白表达量的比较

注：**与空白组比较，P＜0.01；##清眩润目饮组与模型组比较，P＜0.01

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图3 Western blot法检测各组大鼠结膜组织中炎性因子的表达

3 讨论

自拟汤方“清眩润目饮”以养阴润肺健脾，清热祛风除湿为法应用于临床治疗睑板腺功能障碍致蒸发过强型干眼并取得满意疗效[4-6]。 清眩润目饮以增液汤为主方加味而成，增液汤是治疗多种阴虚津亏之基础方。方中玄参，甘苦咸而微寒，入肺经，即清热生津，滋阴润燥，又泻火凉血，为君药。生地黄甘苦而寒，清热养阴，壮水生津，以增玄参滋阴润燥之力；麦冬甘寒、微苦，入肺经，具清热养阴润肺生津之功，滋养肺胃阴津，使水液生化有源，与生地黄共为臣药。白鲜皮，苦寒，入脾经，具有清热燥湿、祛火解毒、祛风止痒之功。金银花甘寒，连翘味苦，二药合用共奏疏散风热、清热解毒之效，且连翘又可消肿散结，增加君臣药的清热作用。防风辛甘而温，入脾经，祛风止痒之效强，又具升清燥湿止痛之功，四药合用可有效改善睑眩赤烂、刺痒等症状，共为佐药。甘草，入脾经，补脾益气，防寒凉之药太过伤及脾胃，入肺经而润肺可增君、臣药之功，清热解毒之功又可助佐药缓解睑弦赤烂症状，调和诸药而为使药。上药合用既能养阴生津润肺健脾，又能清热解毒祛风除湿，是治疗睑眩赤烂所致白涩症的有效方剂。

随着抗炎治疗的广泛应用，通过现代研究发现，很多中药均具有良好的抗炎作用，且毒副作用小。现代研究表明增液汤具有增加水液分泌，调节免疫炎症的功效。孙丽英等[9]发现增液汤能降低干燥综合征 （SS）模型小鼠血清中TNF-α和IL-1β的表达水平，减少炎性细胞因子产生。从现代药理学研究养阴清热方清眩润目饮的药物组成及功效表明：玄参具有抗炎、免疫调节等功效,其有效成份可通过激活核因子 -κB（NF-κB）通路抑制 IL-1β 及 TNF-α 的表达[10]，降低炎性因子的浓度。生地黄中的地黄多糖能促进树突状细胞的成熟，下调由于IL-12和TNF-α生成诱导的泡饮和吞噬作用，增强宿主免疫[11]，生地黄还具有皮质激素样免疫抑制作用[12]。麦冬中提取到的多种类型化合物(如皂苷、黄酮、呋喃等)都可从不同途径抑制炎症发展[13]。白鲜皮提取物具有良好的抑菌活性，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑制作用[14]。金银花[15]对急性炎症的作用与地塞米松、皮炎平的药理作用相当，可调节机体免疫力，对感染性疾病具有治疗作用。连翘具有免疫调节及抗炎作用[16]：其抗炎机制可能与抑制TNF-α和IL-6这两种炎症因子的生成和多成分作用有关。防风有解热、镇痛、抗炎、抗过敏、调节免疫等药理作用[17]。甘草酸苷与多种细胞表面不同的受体如Toll样受体2（TLR2）、TLR4结合，活化下游信号，如P38MAPK、pJNK 和 NF-κB，上调 TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，引起炎症反应[18-19]。

既往研究证实炎性细胞因子IL-1，IL-6，TNF-α和β的水平在蒸发过强型干眼患者泪液和结膜上皮中较正常人显著升高，且与干眼的严重程度相关，这些因子可作为临床诊断或疗效监测的重要参考指标[20]。TLR4是最早发现且研究最多、最清楚的TLR相关蛋白，通过其下游的髓样分化因子88（MyD88）依赖性及非依赖性信号转导通路两个路径，NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路，诱导炎性介质（IL-1α、IL-6、TNF-α、MMPS 等）释放。 目前已证实MAPK信号转导通路与NF-κB信号转导通路直接参与干眼免疫反应的启动[21]。干燥环境、泪液高渗等外界环境刺激可影响TLR4的活性，激活MAPK与NF-κB信号转导通路并影响细胞的增殖、分化、凋亡以及炎性介质的释放。结合本次实验结果表明：清眩润目饮可显著降低蒸发过强型干眼模型动物泪液中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量，这说明本方具有良好的抗免疫性炎症作用。蒸发过强型模型鼠的角、结膜组织中发现TLR4、MyD88因子亦呈升高趋势，服用中药清眩润目饮后，给药组TLR4、MyD88因子表达较模型组显著降低，具有统计学意义 （P=0.000）。实验病理学观察亦显示，用药28 d后，模型组实验鼠球结膜炎症程度最重，清眩润目饮组大鼠角膜、结膜上皮损伤恢复，细胞层数及细胞形态接近正常，部分组织仍可见上皮表面不连续，杯状细胞较模型组增多，偶见炎性细胞浸润。因此，我们认为清眩润目饮及其有效成分在蒸发过强型干眼的治疗中发挥作用，基于免疫的非感染性炎症与干眼的密切关系，推测清眩润目饮对蒸发过强型干眼的免疫调节作用主要通过干预TLR4及其信号转导通路，减少炎性细胞因子释放，减缓杯状细胞凋亡而发挥其药理用。