纤维素酶-乙醇结合法提取生姜总黄酮的工艺研究

孙晓玲

(长春职业技术学院 食品与生物技术分院，长春 130033)

生姜是姜科草本植物，是我国传统常用调味料之一，具有散寒、健胃、驱风、止吐等能效[1]。研究证明生姜中含有生姜油、姜辣素、黄酮和多糖类等生物活性成分，具有抗菌、抗氧化、降血脂等功能[2-5]。其中黄酮类化合物广泛存在于天然产物中，是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物。 黄酮类化合物可改善血管的通透性，降低血脂和胆固醇，防治老年高血压等，是人们日益接受的一种天然活性成分。研究显示生姜中的黄酮成分主要为双羟黄酮，其提取液具有良好的抗氧化活性，对不同自由基具有良好的清除作用，能有效抑制油脂的氧化；生姜黄酮还具有一定的抑菌作用，对食品常见污染菌有一定的抑制作用[6，7]。目前应用于提取生姜总黄酮的方法主要有浸提法、回流提取法和超声提取法。上述提取方法主要利用不同高浓度的乙醇和甲醇，本文应用纤维素酶-乙醇结合法提取生姜总黄酮，考察了纤维素酶添加量、乙醇浓度、固液比等因素对黄酮提取率的影响，并通过优化试验确定最优提取工艺，建立适合于生产应用的生姜总黄酮的提取工艺，为其实际生产利用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生姜：市售；纤维素酶：信得利生物工程有限公司；芦丁：中国药品生物制品检定所；亚硝酸钠、硝酸铝等试剂：均为分析纯。

KQ-500E超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；722可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；SC-3610 低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；CP214电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司。

1.2 纤维素酶-乙醇结合法提取生姜黄酮

生姜样品处理方法：生姜用清水冲洗干净后，切成薄片，40 ℃鼓风干燥，粉碎后过40目筛得提取实验样品。

纤维素酶-乙醇提取方法：称取生姜样品1.00 g，加入适当浓度乙醇溶液，置于水浴锅内加温至设定温度后，用0.1 mol/L的HCl和NaOH溶液调整pH值，添加一定量的纤维素酶，保持恒温酶解提取一定时间后，在沸水浴上灭酶10 min，经4000 r/min速度离心10 min，取上清液备用。

1.3 单因素试验和正交试验设计

试验中以总黄酮提取率为考察指标，选择主要影响因素进行考察，包括乙醇浓度、酶添加量、酶解温度、酶解时间、pH、固液比6个因素。

选用正交试验设计对提取条件进行优化，以总黄酮提取率为评价指标，在单因素试验的基础上确定需要进行优化的试验条件，从而确定纤维素酶-乙醇结合法提取生姜总黄酮的最佳工艺条件。

1.4 总黄酮测定方法

参考《保健食品功效成分检测方法》测定样品中总黄酮含量，以芦丁为标准品，并以30%乙醇为溶剂，配制浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准溶液[8]。分别取芦丁标准溶液0，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.4 mL亚硝酸钠溶液(5%)，静置5 min后，加入0.4 mL硝酸铝溶液(10%)，放置6 min后加入4 mL氢氧化钠溶液(4%)，用30%乙醇定容后混匀，静置10 min，在510 nm波长处测定吸光度值，绘制标准曲线，得到回归方程为：y=10.12x-0.0032，mg/mL，相关系数r2=0.9989。

1.5 总黄酮提取率计算方法

生姜中黄酮含量的计算公式如下，以干燥后生姜样品计算，单位为g/100 g。

式中：X为生姜样品中黄酮的含量，g/100 g;m为生姜样品的质量，g；C为生姜提取液中的黄酮浓度，mg/mL；F为稀释倍数。

1.6 超声法提取生姜总黄酮

称取样品适量，以80%的乙醇为溶剂，按照料液比为1∶40(g/mL)加入溶剂，超声波提取时间2 h，4000 r/min离心5 min，取上清液测定。

1.7 回流提取法

称取样品适量，以80%的乙醇水溶液为溶剂，固液比为1∶2，在80 ℃下回流3 h，4000 r/min离心5 min，取上清液测定。

1.8 生姜总黄酮清除羟自由基活性的测定

样品测定液的制备：称取姜粉10.00 g，按照不同方法的最优提取工艺提取生姜总黄酮，滤液减压浓缩回收乙醇后，真空干燥得提取物；以水为溶剂，制备浓度为25 μg/mL的待测液备用。

清除羟自由基活性的测定：取分别加入1.5 mL的2 mmol/L 硫酸亚铁、30 mmol/L过氧化氢、6 mmol/L水杨酸，混合后将试管放入37 ℃水浴中，加热15 min后取出，在λ=510 nm处测量其吸光度值A1；然后加入不同提取方法提取的生姜总黄酮溶液2.0 mL，混匀，置于37 ℃水浴加热15 min，取出放置于室温下，测其吸光度值A2。以蒸馏水作空白对照，以2 mL样品液加4.5 mL蒸馏水作为参比并测其吸光度值A3，已消除样品液中物质对吸光值的干扰[9]。

2 结果与讨论

2.1 乙醇浓度的确定

称取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分别加入浓度为0，10%，20%，30%，40%，50%的乙醇水溶液，调节pH到5.0后，按照干燥样品粉末计为1.0%的添加量，加入纤维素酶，在50 ℃下提取1 h。同时做不同浓度乙醇生姜粉提取液的对照样，得总黄酮提取率，结果见图1。

图1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响Fig.1 The effects of ethanol volume fraction on the yields of total flavonoids

由图1可知，与乙醇浸提法(对比法)相比，纤维素酶-乙醇结合法提取姜粉总黄酮提取率高于对比方法，说明纤维素酶的加入更有利于原料基质中黄酮成分的溶出，提高目标成分的提取效率。分析图1中曲线可知，当乙醇浓度在0～30%之间时，姜粉总黄酮提取率随乙醇浓度的增大而增加，酶解作用和乙醇浸提作用同时发挥，起到正向协同的作用；当乙醇浓度增大到50%时，总黄酮提取率降低，与浸提法基本一致。推测是因为高浓度的乙醇溶液对酶活性有所抑制，影响酶解作用的发挥，乙醇浸提工艺发挥主导作用。因此在优化试验中，乙醇浓度确定在25%～35%之间。

2.2 pH的确定

称取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分别加入浓度为30%的乙醇溶液，分别调节pH到4.0，4.5，5.0，5.5，6.0后，按照干燥样品粉末计为1.0%的添加量，加入纤维素酶，在50 ℃下提取1 h，得总黄酮提取率，结果见图2。

图2 提取液pH值对总黄酮提取率的影响Fig.2 The effects of pH value of extracting solution on the yields of total flavonoids

由图2可知，在pH 4～6的范围内，姜粉总黄酮提取率波动范围不大，在0.50%～0.65%之间。当pH为5.0时，姜粉总黄酮为0.65%，达到最大值；继续增大pH，总黄酮提取率反而降低。这是因为pH会影响纤维素酶的活性，而其活性又会影响酶解作用的发挥。纤维素酶的最适合酶解pH一般在4.5～6.0之间，在本试验的基质体系中，最适pH为5.0。在后续优化试验中，确定反应体系pH为5.0。

2.3 酶添加量的确定

称取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分别加入浓度为30%的乙醇溶液，调节pH到5.0后，按照干燥样品粉末计为0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的添加量，加入纤维素酶，在50 ℃下提取1 h，得总黄酮提取率，结果见图3。

图3 酶添加量对总黄酮提取率的影响Fig.3 The effects of enzyme dosage on the yields of total flavonoids

由图3可知，反应体系因为纤维素酶的参与，总黄酮提取率增加，高于未添加纤维素酶的试验对照组。随着酶添加量的增加，生姜总黄酮提取率增加到0.67%，但当纤维素酶添加量达到1%后，总黄酮提取率增长缓慢，酶添加量与姜粉质量达到平衡，因此优化试验中，酶添加量确定在0.5%～1.5%之间。

2.4 反应温度的确定

称取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分别加入浓度为30%的乙醇溶液，调节pH到5.0后，按照干燥样品粉末计为1.0%的添加量，加入纤维素酶，分别在30，40，50，60 ℃下提取1 h，得总黄酮提取率，结果见图4。

图4 酶解温度对总黄酮提取率的影响Fig.4 The effects of extraction temperature on the yields of total flavonoids

由图4可知，随反应体系温度的升高，姜粉总黄酮提取率随之增加。当酶解温度为50 ℃时，姜粉总黄酮提取率达到最高值0.64%。继续提高温度未能起到提高总黄酮提取率的作用，温度低于50 ℃，不利于纤维素酶活性的发挥。因此在优化试验中，确定酶解温度为50 ℃。

2.5 固液比的确定

称取生姜粉1.00 g，按照固液比分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，分别加入浓度为30%的乙醇溶液，调节pH到5.0后，按照干燥样品粉末计为1.0%的添加量，加入纤维素酶，在50 ℃下提取1 h，得总黄酮提取率，结果见图5。

图5 固液比对总黄酮提取率的影响Fig.5 The effects of solid-liquid ratio on the yields of total flavonoids

由图5可知，姜粉总黄酮提取率随溶剂用量的增加而增加。增加溶剂用量可以增大基质与溶剂的接触面积，有利于总黄酮成分的浸出。当料液比达到1∶30时，总黄酮提取率增大幅度减慢，因此选择固液比1∶20，1∶30和1∶40为优化试验固液比的3个水平。

2.6 提取时间的确定

称取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分别加入浓度为30%的乙醇溶液，调节pH到5.0后，按照干燥样品粉末计为1.0%的添加量，加入纤维素酶，在50 ℃下分别提取1，1.5，2，2.5，3 h，得总黄酮提取率，结果见图6。

图6 提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.6 The effects of extraction time on the yields of total flavonoids

由图6可知，随着提取时间的延长，姜粉总黄酮提取率不断增加，给反应体系目标成分溶出足够的时间。但当提取时间达到2 h后，总黄酮提取率明显高于1 h时总黄酮提取率，并基本达到稳定；继续延长提取时间，总黄酮提取率增长缓慢，因此，确定2 h为最佳提取时间。

2.7 最优提取条件的确定

在单因素试验的基础上，确定在优化试验中选择乙醇浓度、酶添加量和固液比为考察因素，利用正交试验设计法采用L9(34) 正交表进行试验设计，其他提取参数分别为提取温度50 ℃、提取时间2 h，pH5.5，正交试验因素、水平和结果分析见表1，方差分析结果见表2。

表1 L9(34) 正交试验直观分析表Table 1 Results of L9(34) orthogonal experiment intuitive analysis

续 表

由表1可知，影响生姜总黄酮提取率的主次因素为B>A>D，即酶添加量>乙醇浓度>固液比；确定总黄酮的最佳提取条件组合为A3B3D3，即乙醇体积分数为35%，酶添加量为1.5%，固液比为1∶40。

表2 正交试验方差分析表Table 2 Results of variance analysis of orthogonal experiment

由表2方差分析结果可知，在纤维素酶-乙醇结合法提取生姜总黄酮的优化试验中，考察的3个因素对试验结果均无显著性影响，主要是因为考察因素水平设置的较接近最优条件，梯度范围较小的原因，从而使得因为因素水平变化引起得率波动范围相对较小。

根据单因素试验和正交试验的结果，确定纤维素酶-乙醇结合法提取生姜总黄酮的最佳提取工艺参数：乙醇体积分数为35%，pH值为5.0，酶添加量为1.5%，提取温度为50 ℃，固液比为1∶40，提取时间为2 h。按照此条件重复进行6次验证试验，可得姜粉总黄酮平均提取率为0.79%，RSD为0.431%。结果证明纤维素酶-乙醇结合法提取生姜粉总黄酮成分提取率高、提取效果稳定。

2.8 3种提取方法的对比分析

分别采用纤维素酶-乙醇结合法、超声提取法和回流法提取姜粉总黄酮，得总黄酮提取率分别为0.79%，0.72%，0.73%。由此可知3种提取法所得结果相近，提取率均高于0.7%。对比分析3种提取方法，纤维素酶-乙醇结合法和超声提取法提取时间比回流提取法短1 h；对比超声提取法，纤维素酶-乙醇结合法和回流法更易实现工业化生产；从能耗角度分析，纤维素酶-乙醇结合法和超声提取法能耗较低。综上分析可得应用纤维素酶-乙醇结合法提取生姜总黄酮具有提取率高、提取时长较合理、能耗低、适合工业化生产和环保等优点。

2.9 羟自由基清除活性

选取羟自由基清除法测定生姜的抗氧化性质，并对比分析3种提取方法生姜提取物和抗氧化剂Vc的羟自由基清除活性，结果见图7。

图7 不同提取方法生姜总黄酮提取率和羟自由基清除活性的对比Fig.7 Comparison of extraction rates and hydroxyl radical scavenging activities of flavonoids in ginger by different extraction methods

注：1为纤维素酶-乙醇结合法；2为超声提取法；3为回流提取法。

由图7可知，不同提取方法生姜总黄酮提取物对羟自由基清除能力的大小分别为纤维素酶-乙醇结合法>超声法>Vc>回流法。由此可知，3种提取方法获得的生姜提取物具有较好的羟自由基清除活性，其中纤维素酶-乙醇结合法和超声提取法获得的生姜提取物的羟自由基清除活性高于Vc，说明生姜提取物具有较好的抗氧化活性。

3 结论

本文选用纤维素酶-乙醇结合法提取生姜总黄酮，发挥纤维素酶酶解样品基质纤维结构，结合乙醇的渗透和溶出作用实现生姜总黄酮的高效提取。利用单因素试验和正交试验优化设计确定最优提取条件。单因素实验中考察了纤维素酶添加量、酶解时间、酶解温度等6个主要影响因素对生姜粉总黄酮提取率的影响。在此基础之上确定酶添加量、乙醇浓度和固液比为优化试验中的考察因素，并确定了最优提取条件：乙醇体积分数为35%，pH为5.0，酶添加量为1.5%，提取温度为50℃，固液比为1∶40，提取时间为2h。在最优条件下，纤维素酶-乙醇结合法提取生姜总黄酮的得率为0.79%，高于超声提取法和回流提取法。纤维素酶-乙醇结合法提取生姜总黄酮提取物的羟自由基清除活性也高于VC、超声提取物和回流提取物。以上研究结果证明，纤维素酶-乙醇结合法可以较好地实现生姜总黄酮的高效提取，更好地保持其生物活性。