海藻糖酶应用于谷氨酸发酵的研究

丛泽峰，彭超*，张宇，王林，丛琦林，陈美君

(1.中粮生化能源(龙江)有限公司，黑龙江 齐齐哈尔 161100；2.潍坊医学院，山东 潍坊 261042；3.山东师范大学 生命科学学院，济南 250014)

在温敏型谷氨酸发酵生产过程中，需要消耗大量的葡糖糖供菌体生长利用，发酵前期，糖的消耗用于菌体生长；发酵中后期，糖的消耗用于合成谷氨酸[1]。发酵过程中随着发酵环境的不断改变，谷氨酸菌体受环境变化影响逐步合成海藻糖[2]；海藻糖由2个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成，不含有游离的醛基，不易降解为还原性单糖，可通过海藻糖酶分解[3]。谷氨酸菌体不能消耗利用海藻糖，影响发酵后期代谢物的合成，增加了流加糖的消耗，并对提取工序谷氨酸等电结晶工艺造成一定影响。为了进一步提高谷氨酸发酵的收率及降低味精的生产成本，通过进行谷氨酸发酵工艺优化，在发酵后期27～28 h加入海藻糖酶，将海藻糖转化成葡萄糖，供谷氨酸菌体二次利用。经过工艺优化，发酵后期添加海藻糖酶后，谷氨酸发酵产酸17.6 g/L，比发酵工艺调整前产酸提高了0.6%左右，发酵糖酸转化率提高了0.9%左右，温敏型谷氨酸发酵的综合水平均有所提高。

1 材料与方法[4-6]

1.1 实验材料及主要试剂

温敏型谷氨酸菌种、生产用玉米浆、豆粕水解液、谷氨酸菌体蛋白：均由中粮生化能源(龙江)有限公司提供；谷氨酸菌体蛋白水解液：自制；甜菜糖蜜：北方制糖厂；聚醚消泡剂：济南易丰化工厂；海藻糖酶：杰能科(中国)生物工程有限公司；其他实验试剂：均购于天津科密欧有限公司。

1.2 实验主要仪器及设备

谷氨酸种子罐、谷氨酸发酵罐 国强生化公司；生物传感仪 山东省科学院生物研究所；pH计 上海雷磁仪器厂；HH-S4型数显恒温水浴锅、722S型分光光度计。

1.3 培养基

种子培养基：葡萄糖25 g/L，生产用玉米浆30 mL/L，尿素 5.0 g/L，酵母浸膏3.0 g/L，磷酸氢二钾1.7 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰1 mg/L，硫酸亚铁1 mg/L，维生素B1100 μg/L，维生素H 120 μg/L，pH 7.0，0.1 MPa，灭菌20 min。二级种子培养基：淀粉糖29 g/L，玉米浆20 mL/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，硫酸镁 0.6 g/L，硫酸锰0.2 mg/L，硫酸亚铁0.2 mg/L，维生素B1200 μg/L，维生素H 120 μg/L，pH 7.0，灭菌20 min。基础发酵培养基：淀粉水解糖50 g/L，玉米浆20 mL/L，豆粕水解液22 g/L，糖蜜45 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，硫酸镁1.2 g/L，硫酸锰35 mg/L，硫酸亚铁20 mg/L，维生素B1300 μg/L，维生素H 400 μg/L，聚醚消泡剂1 mL/L，补料糖浓度为55%，分别采用1，2，3 mg/L，pH 7.0，0.1 MPa，灭菌20 min。

1.4 实验方法

1.4.1 菌体蛋白水解液

烧杯内装1.2 kg谷氨酸菌体蛋白，加入1.0 L浓硫酸，恒温水浴锅内116 ℃维持15 h，终了取抽滤液。

1.4.2 摇瓶种子培养

试剂瓶内装有一定量的种子培养基，经灭菌后接入活化菌液，置摇床震荡培养14 h，经检验合格后，置于冰箱内保藏。

1.4.3 种子罐培养

种子罐内装入一定量的培养液，经灭菌后接入摇瓶种子进行培养，培养16 h左右，经检验合格后，置于冰箱内保藏。

1.4.4 发酵罐培养

发酵罐内装入一定量的发酵培养液，经灭菌后接入种子罐内的种子进行培养，33 ℃，通气量90 mL/min，200 r/min；OD值为1.0时，温度提高到38 ℃，转速提高到800 r/min；残糖在1%左右时流加糖液。控制pH在7.1左右，发酵培养40 h左右。发酵终了测定谷氨酸含量、总用糖量，核算糖酸转化率(本文简称转化率)。

1.4.5 分析方法

OD值的测定：将发酵样品稀释，用722S分光光度计测定吸光值；pH值的测定：采用pH计测定；还原糖和酸浓度的测定：采用生物传感分析仪测定。发酵过程中，间隔2 h取一次样，测定还原糖和酸浓度。

谷氨酸发酵糖酸转化率的计算[7]：

糖酸转化率=(酸含量×发酵液体积)/(底糖浓度×发酵初体积+流加糖浓度×流加糖体积)×100%。

1.4.6 实验方法

在温敏型谷氨酸发酵过程中根据发酵机理间歇添加不同量的海藻糖酶。通过对比谷氨酸发酵产酸率、转化率、残糖及OD值综合分析发酵结果。实验方案1：原发酵培养基为对照组；实验方案2：添加不同量的海藻糖酶进行谷氨酸发酵。

2 实验结果与分析

2.1 不同发酵周期添加海藻糖酶对发酵产酸的影响

温敏型谷氨酸发酵过程中由于发酵环境的不断改变，菌体受pH值、温度、压力等环境变化影响不断代谢积累海藻糖，经过多批次实验后，选用发酵周期27～28 h时间段添加海藻糖酶可以有效提高发酵产酸，结果见图1。

图1 不同发酵周期添加海藻糖酶对产酸的影响Fig.1 The effect of trehalase on the acid yield in different fermentation periods

温敏型谷氨酸发酵过程中，由于发酵环境的不断改变，谷氨酸菌体受环境变化影响逐步代谢积累合成海藻糖。发酵后期，谷氨酸菌种活力逐步衰退，产酸能力逐渐减弱，随着海藻糖的增多，反馈抑制影响发酵产酸水平。通过工艺优化，发酵后期采用添加海藻糖酶有效酶解发酵液中的海藻糖，有利于进一步提高发酵产酸。由图1可知，在发酵后期，2组发酵产酸接近，27～28 h添加海藻糖酶后，加酶组的发酵产酸明显高于不加酶组0.6%左右。

2.2 海藻糖酶添加量对发酵产酸的影响

将海藻糖酶采用1，2，3 mg/L 3种添加量分别添加到发酵液中，实验结果见表1。

表1 添加不同量海藻糖酶发酵产酸结果Table 1 The acid production results by adding different amount of trehalase

温敏型谷氨酸发酵培养过程中，添加不同量的海藻糖酶对发酵产酸有很大的影响，通过添加不同量的海藻糖酶进行对比，按照1 mg/L的添加量发酵产酸较好，见图2。

图2 不同添加量海藻糖酶对产酸响Fig.2 The effect of different additive amount of trehalase on acid production

2.3 添加海藻糖酶对发酵糖酸转化率的影响

温敏型谷氨酸发酵后期，通过添加海藻糖酶将谷氨酸发酵代谢过程积累的海藻糖进行酶解合成可被谷氨酸菌利用的单糖，替代了一部分需要流加的水解糖，发酵产酸进一步提高的同时，发酵的糖酸转化率也随之提高，见图3。

图3 添加海藻糖酶对发酵糖酸转化率的影响Fig.3 The effect of adding trehalase on the sugar-acid conversion rate

3 结论

本次实验结果表明：温敏型谷氨酸菌种在发酵过程中，发酵后期27～28 h添加海藻糖酶，发酵产酸提高0.6%左右，发酵糖酸转化率可以提高0.9%左右，采用添加海藻糖酶的方法对温敏型谷氨酸发酵生产起到促进作用。