肺腺癌组织精氨酸酶-2的表达及临床意义

肖 锋，徐光寰，顾春燕，邵建国，陈丽燕，孙 艳，肖静文

1.南通大学附属南通第三医院病理科，南通 226006 2.海军军医大学附属长海医院普通外科，上海 200433 3.南通大学附属南通第三医院消化内科，南通 226006

目前，肺癌是全世界所有癌症相关死亡的主要原因之一。非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)是最常见的肺癌类型，其根据组织起源主要包括腺癌和鳞状细胞癌。近年来，肺腺癌发病率明显升高；尽管肺腺癌的治疗取得了长足的进步，但由于其生物学特性复杂、复发转移率高，手术切除后肺腺癌患者的长期生存率仍然较低。因此，更深入地研究与肺腺癌发生和发展相关的因子及分子机制对于肺腺癌的早期诊断、复发和转移的监测，以及疗效和预后的判断具有重要意义。

精氨酸酶-2(arginase-2, Arg-2)是生物体新陈代谢过程中重要的催化酶，主要催化L-精氨酸水解成尿素和L-鸟氨酸。Arg-2在人类多种恶性肿瘤中异常表达。本课题组前期研究显示[1-2]，肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)组织中Arg-2异常表达，并且与HCC组织学分级、细胞增殖和凋亡等相关。本研究拟进一步探讨Arg-2在肺腺癌中的表达情况及临床病理学意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取南通大学附属南通第三医院2011年12月至2017年10月收集的病例资料完整的肺浸润性腺癌手术切除标本(包括癌及其癌旁组织)108例。浸润性肺腺癌的诊断参考国际肺癌研究协会/美国胸科学会/欧洲呼吸学会国际肺腺癌多学科分类分型诊断标准[3]。组织学分级标准：(1)高分化，以贴壁结构为主；(2)中分化，包括乳头状、腺泡结构为主和浸润性黏液腺癌；(3)低分化，以实体和微乳头状结构为主[4]。所有病例均经过2位中级以上职称的病理医师复习诊断，并接受6个月～6年生存随访。另外，收集7例新鲜的肺腺癌组织标本和1例正常肺组织标本，正常肺组织为肺大疱手术切取的周围肺组织；-80℃保存。本研究通过南通市第三人民医院伦理委员会审核批准。

1.2 RT-PCR实验 参照TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)说明书提取新鲜组织中总RNA，紫外分光光度计测定D260及D280值，计算RNA总含量。反转录反应根据反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)使用说明进行，将所合成的cDNA保存于-20℃以备用。Arg-2上游引物：5′-AAG CTG GCT TGA TGA AAA GGC-3′，下游引物：5′-GCG TGG ATT CAC TAT CAG GTT GT-3′，产物长度为119 bp；内参GAPDH上游引物：5′-CCA TTT GCA GTG GCA AAG-3′，下游引物：5′-CAC CCC ATT TGA TGT TAG TG-3′，产物长度为202 bp。PCR反应体系总体积为20 μL，反应条件：94℃ 5 min；94℃ 45 s、58℃ 45 s、72℃ 45 s，共30个循环；72℃ 8 min。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，最后用凝胶分析系统对目的条带进行半定量分析。

1.3 蛋白质印迹实验 将冻存的新鲜组织标本取出称取质量，加入蛋白裂解液，冰浴匀浆。待组织完全打碎后，以12 000×g的相对离心力于4℃离心30 min，取上清液测定蛋白含量。对蛋白样品行SDS-PAGE，电泳结束后进行湿式电转移。转移后的PVDF膜于室温封闭2 h，分别加入兔抗人多克隆Arg-2和小鼠抗人单克隆β-actin一抗(Santa Cruz公司产品)，室温孵育1 h后，4℃过夜。TBST漂洗后，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔/小鼠二抗，室温孵育2 h，TBST漂洗。ECL发光，暗室中显影，定影。

1.4 免疫组织化学实验及结果判定 采用EnVision二步法进行免疫组织化学检测，具体步骤参照免疫组织化学试剂盒(上海基因科技有限公司)说明书进行。手术标本离体30 min内行固定、常规组织学脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋处理，4 μm厚切片。实验设阳性和阴性对照。柠檬酸盐高压抗原修复后，加入一抗4℃孵育过夜，然后加入二抗室温孵育2 h，DAB显色。由2位中级以上病理医师采用双盲法评定染色结果。每张切片在400倍放大光学显微镜下随机选择5个视野，计数1 000个癌细胞，计算染色细胞阳性率。采用半定量积分法对癌细胞染色强度和染色细胞阳性率进行评分。染色强度分为4个等级：棕褐色为3分，棕黄色为2分，浅黄色为1分，无着色为0分。染色细胞阳性率分为5个等级：81%～100%为4分，51%～80%为3分，11%～50%为2分，1%～10%为1分，无染色细胞为0分。将2组评分相乘所得值，分为2个等级：0～4分为低表达，5～12分为高表达。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件分析处理数据。对免疫组织化学检测结果行χ2检验，组间比较采用Spearman秩相关分析。对随访结果行单因素分析，总生存率分析用log-rank检验，并绘制Kaplan-Meier生存曲线。应用多因素Cox比例风险模型评估对生存有明显影响的独立因素。检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 Arg-2在新鲜肺腺癌组织中高水平表达 RT-PCR检测1例正常肺组织和7例肺腺癌组织中的表达，结果(图1A)显示：在正常肺组织中，Arg-2 mRNA无表达；而在7例新鲜肺腺癌组织中，有6例(case1、2、3、5、6、7)Arg-2 mRNA表达水平明显升高，对应的癌旁肺组织中Arg-2 mRNA不表达或低表达，另外1例患者(case 4)的癌组织和癌旁组织中均不表达Arg-2 mRNA。蛋白质印迹法检测结果(图1B)显示：Arg-2在蛋白水平的表达情况与mRNA水平基本一致。以上结果说明，Arg-2在癌旁肺组织中不表达或低表达，而在肺腺癌组织中表达水平明显升高。

2.2 Arg-2在肺腺癌组织中表达率升高 应用免疫组织化学法进一步检测Arg-2在108例肺腺癌及其对应癌旁肺组织中的表达情况，结果显示：Arg-2阳性信号定位于细胞质(图2)；在108例肺腺癌组织中，Arg-2蛋白低表达者74例，高表达者34例；而对应的108例癌旁组织中Arg-2蛋白均低表达。因此，Arg-2在肺腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.000 1)。

图1 RT-PCR(A)和蛋白质印迹法(B)分别检测1例正常肺组织、7例肺腺癌及相应癌旁肺组织中Arg-2 mRNA和蛋白的表达

图2 免疫组织化学法检测Arg-2在肺腺癌组织中的表达及细胞定位(EnVision二步法)

A：Arg-2在肺腺癌组织中高表达；B,C：图A的局部放大，B示Arg-2高表达于癌细胞的细胞质，C示癌旁肺组织中不表达Arg-2；D：Arg-2在肺腺癌组织中低表达；E,F：图D的局部放大，E示Arg-2低表达于癌细胞的细胞质，F示癌旁肺组织不表达Arg-2.Origiral magnification: ×100(A,D), ×400(B,C,E,F)

2.3 Arg-2表达与肺腺癌临床病理指标的相关性分析 结果(表1)显示：Arg-2蛋白表达与肺腺癌的分化程度(P=0.000 6)、淋巴结转移(P=0.002 8)、TNM分期(P=0.021 5)以及Ki-67指数(P<0.000 1)正相关，而与肺腺癌患者的性别、年龄、吸烟状态及肿瘤大小均无显著相关。

表1 Arg-2表达与肺腺癌临床病理特征的相关性 n, N=108

2.4 Arg-2蛋白与肺腺癌患者预后的相关性分析 Kaplan-Meier生存曲线(图3)显示：Arg-2低表达组肺腺癌患者的中位生存时间为42个月，Arg-2高表达组肺腺癌患者的中位生存时间为17个月；log-rank检验结果显示，Arg-2高表达组的总生存率明显低于Arg-2低表达组，两组间差异有统计学意义(χ2=6.762,P=0.009)。进一步应用Cox比例风险模型分析Arg-2高表达对肺腺癌患者生存的影响，结果(表2)显示：Arg-2高表达组与低表达组的危害比(hazard ratio, HR)为0.492，95%可信区间(confidence interval，CI)为0.241～1.004(P=0.051)，提示Arg-2高表达不是肺腺癌的独立预后因素。

图3 Arg-2低表达与高表达组肺腺癌患者的生存曲线

表2 多因素Cox比例风险模型分析肺腺癌的独立预后因素

SE：标准误差；DF：自由度；HR：危害比；CI：可信区间；Lower：下限；Upper：上限.*显著相关

3 讨 论

Arg-2是一种线粒体酶，基因定位于染色体14q24.1-24.3，广泛分布于脑、乳腺、前列腺和肾脏等脏器[5-6]，其主要功能是促进人体新陈代谢，并调节免疫功能等。有研究表明，Arg-2的异常表达与癌症有着密切的关联。Arg-2在前列腺癌和乳腺癌等肿瘤组织中高水平表达[7-8]。本研究组之前的研究发现，Arg-2在HCC组织中也存在异常表达，表达强度与HCC的组织学分级正相关，提示Arg-2可能与HCC的生物学行为相关[1]。最近本研究组进一步研究显示，HCC组织中Arg-2表达与细胞增殖标志物Ki-67和细胞周期调控蛋白cyclin D1表达正相关，提示Arg-2异常表达可能参与调节HCC细胞的增殖过程[2]。

本研究结果显示Arg-2 mRNA和蛋白表达水平在肺腺癌组织中明显升高，而且Arg-2蛋白在肺腺癌组织中异常高表达与肺腺癌组织分化差、淋巴结转移、TNM分期及增殖指数高正相关。因此，Arg-2高表达可能提示肺腺癌患者预后差。Costa等[9]研究也显示，过表达Arg-2能够促进成胶质细胞瘤中基质金属蛋白酶2/9表达，进而促进肿瘤细胞增殖、迁移和血管生成。以上2项研究结果均表明，Arg-2与肿瘤的恶性生物学行为密切相关，Arg-2可能在其中发挥重要作用。由于纳入本研究的少部分病例的随访时间较短，故本研究进一步行多因素Cox比例风险模型分析，结果显示Arg-2高表达不是独立的危险因素。本研究结果表明，Arg-2可能在肺腺癌的侵袭和转移中起着重要的作用，Arg-2高表达提示预后差，但不是独立的预后因素。

分析Arg-2发挥生物学功能的作用机制，可能包括以下途径：Arg-2通过催化精氨酸，合成精胺和亚精胺等，在促进细胞增殖和分化过程中发挥非常重要的功能[10-11]。Arg-2与诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)均以精氨酸作为催化底物，Arg-2通过竞争性催化精氨酸，调节iNOS催化合成NO的量，从而影响NO发挥调节肿瘤血管生成[12]、细胞毒性反应及肿瘤免疫等生物学功能，最终调控肿瘤的增殖和凋亡等生物学进程。本研究组近期也报道，Arg-2与iNOS在HCC组织中的表达正相关，且与HCC微血管密度相关，提示Arg-2与iNOS可能参与调节HCC微血管的形成[13]。另外，Arg-2与淋巴细胞介导的肿瘤免疫有关。Arg-2通过水解精氨酸，抑制T细胞增殖，最终影响机体对肿瘤细胞的免疫抑制功能[14-15]。McGovern等[16]的研究结果表明，在人胚胎发育过程中，Arg-2的活化能促进调节性T淋巴细胞产生，从而发挥重要的免疫调节作用；Arg-2还能够激活骨髓源性抑制细胞，这种细胞由肿瘤诱导所产生，主要发挥免疫抑制作用，介导癌症患者的系统性免疫功能障碍和局部的肿瘤免疫逃避[17]。总之，Arg-2可通过多种途径影响肿瘤细胞的生物学行为。

综上所述，本研究明确了浸润性肺腺癌组织中Arg-2的异常表达与组织分化差、淋巴结转移、TNM分期及增殖指数高正相关，提示Arg-2可能参与调控肺腺癌的恶性生物学行为；同时Arg-2高表达提示患者预后差，但不是独立的预后因素。进一步探索Arg-2在肺腺癌组织中的作用机制将拓宽和深化人们对Arg-2功能的更全面的认识，并对阐明肺腺癌的发病机制可能提供新的思路。