miRNAs在活动性肺结核患者和健康人血浆中的差异表达

滕新栋，陈晓光，姜 华，顾长美，朱 可

(1.山东国际旅行卫生保健中心， 山东 青岛 266000； 2.威海出入境检验检疫局， 山东 威海 264200)

microRNAs(miRNAs)是一类微小、非编码和高度保守的单链RNA，可通过靶向信使RNA(mRNA)特异地调节基因表达。它具有多种生物学功能，在肿瘤、糖尿病和感染性疾病等多种疾病中发挥着重要调节作用。研究表明，血清或血浆中的循环miRNAs可作为筛选结核病(tuberculosis,TB)的重要靶标。

肺TB是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，严重威胁着人类健康。据世界卫生组织(WHO)报道，2015年有1 040万新发TB病例，全球人口1/3感染M.tb(M.tuberculosis)[1]。鉴于TB的严重程度和TB诊断方法的发展情况，早期诊断对控制肺TB至关重要，但是目前没有有效的诊断肺TB的靶标。因而，需要发展全新、快速、敏感和有效的标志物来诊断肺TB。

本研究旨在利用高通量测序和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)探讨肺TB患者和健康人血浆中miRNAs的差异表达情况，发现有诊断价值的miRNAs种类，为后续TB诊断试验和机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象:选取青岛市黄岛区结核病防治所的肺TB患者5例，选取标准为痰涂片阳性或痰培养阳性。选取山东国际旅行卫生保健中心的健康人5名，选择标准为T-SPOT.TB阴性，无TB及其他疾病史，未接触过TB患者。所有研究对象均阅读并签署知情同意书，该研究经青岛大学附属医院伦理委员会批准。

1.1.2 试剂:Trizol®Reagent、6% Novex TBE PAGE gel(1.0 mm，10 well)和TBS380 Picogreen(Invitrogen公司)；miRNA第一链cDNA合成(加尾法)试剂盒和2×SG Fast qPCR Master Mix[生工生物工程(上海)股份有限公司)]；TruseqTMSmall RNA sample prep Kit、HiSeq 4000 PE Cluster Kit、HiSeq 4000 SBS Kit(300 cycles)和MiSeq Reagent Kits v3(600 cycles)(Illumina公司)；Certified Low Range Ultra Agarose(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 标本收集:用EDTA抗凝的旋盖采血管收集肺TB患者和健康人的全血样本10 mL，上下颠倒混匀后，3 600×g低温离心5 min，将血浆收集到无RNase/DNase的离心管中，12 000×g低温离心2 min，将上层血浆收集到无RNase/DNase的离心管中，每管保存0.5 mL。将分装好的血浆置于-80 ℃保存待用。

1.2.2 RNA提取和检测:肺TB患者和健康人的血浆中RNA提取和检测委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。用试剂盒提取血浆中总RNA，无RNase水充分溶解总RNA。使用NanoDrop2000检测RNA纯度和浓度，以及Agilent2100检测RIN值。

1.2.3 高通量测序分析miRNAs表达谱:委托上海美吉生物医药科技有限公司采用Illumina Hiseq 4000测序平台完成。具体流程如下：分别连接3′端接头和5′端接头；随机引物反转成1 st Cdna；文库富集(PCR 11～12个循环)；文库纯化(6% Novex TBE PAGE gel，1.0 mm，10孔)；TBS380(Picogreen)定量，按数据比例混合上机；cBot上进行桥式PCR扩增，生成clusters；Hiseq测序平台，进行SE50测序；最后进行生物信息学数据分析。

1.2.4 RT-qPCR检测miRNAs表达:将血浆中提取的miRNA按miRNA第一链cDNA合成(加尾法)试剂盒说明书操作反转录为cDNA。按2×SG Fast qPCR Master Mix(High Rox)试剂盒说明书操作进行RT-qPCR。hsa-let- 7i- 5p、hsa-miR- 28- 3p、hsa-miR- 93- 5p和hsa-let- 7g- 5p的引物F分别为5′-CGCTGAGGTAGTAGTTTGTGCTGTT-3′、5′-ACCACTAGAT TGTGAGCTCCTGGA-3′、5′-ACAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTA G-3′和5′-CGCGCTGAGGTAGTAGTTTGTACAGTT-3′。小核RNA U6作为内参基因， 通用反向引物作为所有基因的反向引物。miRNA的相对表达量采用2-△△Ct法进行计算。

1.3 统计学分析：采用SPSS17.0统计软件进行数据处理分析。t检验比较两组miRNA表达谱的差异，P<0.05为差异统计学意义。

2 结果

2.1 高通量测序筛选肺TB患者和健康人血浆中miRNAs的差异表达：与健康人相比，肺TB患者血浆中有79种miRNAs差异表达，其中有54种miRNAs表达上调，有25种表达下调。血浆miRNAs表达上调倍数在2.02～16.10(表1)，表达下调倍数在2.19～15.16之间(表2)。

表1 肺TB患者和健康人血浆中miRNAs表达上调情况Table 1 Over-expression of miRNAs in the plasma of pulmonary TB and health people

表2 肺TB患者和健康人血浆中miRNAs表达下调情况Table 2 Down-expression situation of miRNAs in the plasma of pulmonary TB and health people

2.2 RT-qPCR证实miRNAs表达：选取hsa-let- 7i- 5p、hsa-miR- 28- 3p、hsa-miR- 93- 5p和hsa-let- 7g- 5p进行RT-qPCR验证，2-△△Ct值分别为3.05±0.30、3.61±0.45、1.75±0.15和0.52±0.06。RT-qPCR证实miRNAs表达与高通量测序结果一致，相比于健康人，肺TB患者hsa-let- 7i- 5p、hsa-miR- 28- 3p和hsa-miR- 93- 5p表达上调，而hsa-let- 7g- 5p表达下调。

3 讨论

血浆中miRNAs具有许多优点，如对时间温度变化的影响小、稳定性好、抗酶降解、抗酸碱等，是1种对于疾病的诊断、治疗和预后有重要意义的生物标志物。本研究成功筛选出79种肺TB患者血浆中差异表达的miRNAs，其中有54种miRNAs表达上调，有25种表达下调，并且证实了hsa-let- 7i- 5p、hsa-miR- 28- 3p和hsa-miR- 93- 5p表达上调，而hsa-let- 7g- 5p表达下调。

近年来， miRNAs诊断TB的研究是1个热点问题，也发现了一些有意义的标志物。与健康人相比：用高通量测序发现91种miRNAs在TB患者血清中差异表达，RT-qPCR证实TB患者血清中hsa-miR- 22、hsa-miR- 29c、hsa-miR- 378和hsa-miR- 483- 5p表达上调，而hsa-miR- 101和hsa-miR- 320b表达下调，并且此6种miRNAs联合敏感度和特异度更高，更适于诊断TB[2]；用高通量测序发现TB患者血清中24种miRNAs表达上调和6种miRNAs表达下调，RT-qPCR证实hsa-miR- 196b和hsa-miR- 376c可诊断TB[3]；利用微阵列技术发现TB患者血清的92种miRNAs中差异表达，miR- 29a和miR- 93*在TB患者血清中表达均上调[4]。本研究利用高通量测序技术分析了肺TB患者和健康人血浆中的miRNAs表达谱，获得了大量miRNAs差异表达的信息，并选取几种miRNAs成功用RT-qPCR证实表达。

总之，本研究筛选出多种miRNAs差异表达，hsa-let- 7i- 5p、hsa-miR- 28- 3p、hsa-miR- 93- 5p和hsa-let- 7g- 5p可作为诊断肺TB潜在的标志物，为后续肺TB诊断实验和机制研究的开展奠定了基础。