甘草甜素促进口腔鳞状细胞癌细胞系Tca8113的凋亡

2018-11-14周峰，陈虎，曾静

基础医学与临床 2018年11期

周峰，陈虎，曾静

(南阳市中心医院口腔科, 河南南阳 473000)

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是口腔额面部最常见的恶性肿瘤。据统计，每年全球新增病例超过26万例，其中死亡人数约有13万例[1- 2]。口腔鳞状细胞癌的发病率相对较低，但中国由于人口基数大，每年的新增病例约有4.56万，发病率呈逐年上升趋势，并呈现年轻化现象[3]。目前手术联合化疗方法是提高OSCC患者生存率的有效方法，临床上主要使用顺铂、氟尿嘧啶和阿霉素对其进行化疗[4]，然而，这些药物的毒副作用大，且容易产生耐药性。

甘草甜素(glycyrrhizin, GL)又称甘草酸，是从药用植物甘草的根茎中提取的三萜类皂苷。研究发现，甘草甜素具有抗感染、抗病毒和抗肿瘤等多种药理学作用。甘草甜素通过抑制血管内皮生长因子的生成，减少血管的生成，从而抑制大鼠结肠癌前病变[5]。有国外学者发现甘草甜素通过增加junB的表达刺激人肝癌细胞系JUNB的表达[6]。由于尚未有文献证明甘草甜素对口腔鳞状细胞癌的作用，本文研究甘草甜素对口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113凋亡作用，并探讨初步的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

口腔鳞状细胞癌细胞系Tca8113(上海邦景实业有限公司)；RPMI1640培养基(HyClone公司)；胎牛血清(上海研卉生物科技有限公司)；甘草甜素(中国药品生物制品鉴定所，纯度>98%)，用二甲基亚砜(终浓度<0.01%)溶解成相应浓度；线粒体膜电位检测试剂盒(碧云天生物有限公司)；线粒体分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)；Cyt-C，β-actin，Cox Ⅳ抗体均(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：将口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113加入含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素溶液的RPMI1640培养基，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞汇合至80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化3 min，进行传代。将细胞分为空白对照组(control)；溶剂对照组(vehicle)，加入相应体积溶剂；药物干预组(GL)，给予40 μmol/L甘草甜素处理24 h。

1.2.2 MTT法检测细胞存活率：取对数增殖期细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1.5×104个/mL，每孔100 μL接种于96孔板中，设3个复孔。待细胞贴壁后，加入甘草甜素使最终浓度分别为0、10、20、40与80 μmol/L，培养24 h，每孔加入MTT试剂20 μL，37 ℃继续培养4 h，吸去孔内液体，每孔加入DMSO 150 μL，摇床上低速振荡10 min，于540 nm波长处测定吸光值(A)，计算细胞存活率。

1.2.3 细胞凋亡测定：将处于对数增殖期的Tca8113细胞以5×104个/孔接种于24孔板中，贴壁培养过夜，采用甘草甜素处理后，把细胞培养液吸去至离心管，加入0.25%胰蛋白酶消化，37 ℃孵育5 min，终止消化，吹打细胞，1 500 r/min离心3 min，收集细胞，用PBS重悬并计数，使浓度为1×106个/mL的细胞悬液；取100 μL细胞悬液依次加入5 μL Annexin V-FITC与5 μL PI，轻轻混匀后室温下避光孵育15 min，加入200 μL的上样缓冲液，设置流式细胞仪激发光波长为488 nm，发射波长为530 nm，用荧光显微镜检测，将细胞混合液离心，取细胞沉淀涂片，再进行观察。

1.2.4 线粒体提取：用线粒体分离试剂盒提取细胞中的线粒体，操作如下：收集约1×107个细胞，于冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞计数，4 ℃ 800×g，离心5 min，弃上清。加入试剂A，离心10 s，冰上孵育1 min，加入试剂B，离心30 s，冰上孵育4 min，其中每隔1 min涡旋振荡1次，加入试剂C，800×g，4 ℃离心5 min。沉淀为线粒体部分。上清，4 ℃ 10 000×g，离心5 min，为胞质部分。

1.2.5 免疫印迹检测蛋白表达：收集细胞，用RIPA细胞裂解液进行裂解，提取总蛋白，测定蛋白含量，调整蛋白浓度。取适量裂解产物，上样后用10%聚丙烯酰胺进行电泳分离，电转至硝酸纤维素膜上，加入5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗室温孵育1 h，洗膜，加入相应二抗室温孵育1 h，化学发光法显色，成像扫描分析系统保存图像，分析条带灰度值，计算目的和内参条带的灰度值。

1.2.6 线粒体跨膜电位检测：线粒体跨膜电位检测根据跨膜电位检测试剂盒说明书进行。通过JC- 1荧光染料指示剂检测线粒体膜电位的改变，并在荧光显微镜下观察红色荧光与绿色荧光强度，使用两者荧光强度比值代表线粒体膜电位的改变。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 甘草甜素抑制Tca8113细胞的增殖

Tca8113细胞的存活率随着甘草甜素浓度增加而下降，当甘草甜素浓度为40 μmol/L时，随着甘草甜素浓度增大，Tca8113细胞的存活率变化不明显，因此，后续实验采用甘草甜素浓度为40 μmol/L进行试验(图1)。

图1 甘草甜素对Tca8113细胞存活率变化的影响Fig 1 Effect of glycyrrhizin on the survival rate of Tca8113 cells

2.2 甘草甜素对Tca8113细胞凋亡的影响

Tca8113细胞的凋亡率显著高于空白对照组(P<0.05)(图2)。

2.3 甘草甜素对线粒体膜电位的影响

空白对照组的Tca8113细胞红色荧光很强，绿色荧光极弱，加入甘草甜素干预后， Tca8113细胞的红色荧光明显减弱，绿色荧光明显加强(图3)。

2.4 甘草甜素对Cyt-C蛋白表达的影响

结果显示加入甘草甜素培养后的细胞线粒体(mito)中Cyt C的蛋白表达显著低于空白对照组(P<0.05)，而胞质(Cyto)中Cyt C的蛋白表达则显著升高(P<0.05)，导致胞质与线粒体中Cyt C的比值增加(P<0.05)(图4)。

5 讨论

随着甘草甜素浓度的增大，甘草甜素对Tca8113细胞存活率的抑制作用增强。当甘草甜素浓度到达40 μmol/L时，继续增加药物浓度，Tca8113细胞的存活率不再发生明显变化，因此，在后续实验中采用40 μmol/L甘草甜素进行研究。提示甘草甜素对口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113的增殖具有抑制作用。另外，流式细胞计量术实验结果显示甘草甜素能够诱导Tca8113细胞的凋亡。

凋亡是指细胞在一定条件下受到刺激信号，经凋亡基因调控，并由一系列酶参与的级联反应的死亡过程。其中涉及不同的基因调控与表达和信号传导体系的正负调节等作用[7]。研究显示，无论是死亡受体信号途径，或是内质网信号途径，最终都会激活线粒体凋亡途径[8]。线粒体凋亡途径主要是以线粒体通透性转换孔(MPTP)的开放为中心环节，当MPTP开放后，各种离子和可溶性物质进入线粒体中，形成质子电化学梯度耗散，从而降低线粒体的跨膜电位，进一步引起Cyt C和其他凋亡活性物质释放入胞质中，引起下游caspase级联反应诱导细胞凋亡[9]。JC- 1是常用的线粒体膜电位指示剂，JC- 1形成聚合物后，产生红色荧光；当线粒体膜电位降低，JC- 1则形成单体，产生绿色荧光；因此，以红色荧光与绿色荧光的比值代表线粒体膜电位的异常[10]。研究发现采用甘草甜素干预后，与对照组相比，Tca8113细胞的红色荧光显著减弱，红色荧光与绿色荧光比值显著降低，表明线粒体膜的通透性改变，提示Cyt C从线粒体内释放到胞质中，出现细胞凋亡。由此可见，甘草甜素可能通过线粒体途径诱导Tca8113细胞的凋亡。