长链非编码RNA GASL1在乳腺癌组织及细胞系中的表达及作用

吴多明，武 力，张晓斌，马大昌

(兰州大学第一医院 乳腺病科， 甘肃 兰州 730000)

乳腺癌是严重影响女性健康最常见的恶性肿瘤。分子生物学快速发展促使乳腺癌的基因治疗成为研究的热点[1]。探寻与乳腺癌相关的抑癌基因和促癌基因为乳腺癌的诊治提供了新的研究方向[ 2]。

长链非编码RNA (long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过 200 nt非编码RNA。研究表明，lncRNA参与包括乳腺癌在内的多种癌的发生发展[3]。与乳腺癌发病、预后和耐药等密切相关的lncRNA不断被发现。新近研究发现了一个新的lncRNA，命名为GASL1(growth-arrest associated lncRNA 1)[4]。GASL1可调节人骨肉瘤细胞U2OS的细胞周期，参与细胞增殖和集落形成。且肝癌患者癌组织中GASL1的表达水平与患者的生存周期呈正相关，上述研究表明GASL1可能是一个新的与癌密切相关的lncRNA。本研究旨在研究GASL1与乳腺癌的关系，将开展工作如下：1)GASL1在乳腺癌患者癌组织与癌旁正常组织中的表达差异；2)GASL1对乳腺癌细胞的增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和试剂：正常的人乳腺细胞系 HBL- 100和人乳腺癌细胞系MDA-MB- 231、MDA-MB- 468、MCF- 7 和 SK-BR- 3(ATCC细胞库)。培基和胎牛血清(BI 公司)。Trizol、RNA 提取试剂盒和反转录试剂(宝生物工程有限公司)。LncRNA GASL1和GAPDH引物、si-GASL1、si-NC、pcDNA3.1、pcDNA3.1-GASL1和 LipofectamineTM2000(广州锐博生物科技有限公司)。MTT、caspase- 3 活性检测试剂盒(碧云天生物技术公司)。Bax一抗、Bcl- 2一抗和羊抗鼠二抗(Abcam公司)。

1.1.2 样本收集：随机选取2015-2016 年在兰州大学第一医院进行乳腺癌切除手术的 30 例乳腺癌患者，所有患者均已经过病理学确诊，签署知情同意书，并由兰州大学第一医院伦理委员会批准。切除术后摘取微量乳腺癌组织(cancer tissues)及癌旁乳腺组织(paracancerous tissue)用于本研究，癌旁组织距离癌组织距离在1 cm左右，冻于-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：用10%胎牛血清高糖DMEM培基培养乳腺癌细胞系(MDA-MB- 231、MDA-MB- 468和SK-BR- 3)及正常乳腺细胞HBL- 100，用10%胎牛血清 RPML1640 培基培养MCF- 7细胞，在 37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染：设计合成3个lncRNA GASL1 siRNA片段和GASL1过表达质粒pcDNA3.1-GASL1。培养瓶中细胞消化后接种于培养板，待细胞汇合至60%左右时，利用LipofectamineTM2000转染lncRNA GASL siRNA或pcDNA3.1-GASL1至细胞内。RT-qPCR检测其转染效率。

1.2.3 细胞增殖、caspase- 3活力和凋亡相关蛋白的检测：用MTT法检测细胞转染后0、12、24和48 h时的细胞活力(即细胞增殖)，用caspase- 3活性检测试剂盒检测caspase- 3，Western blot检测Bcl- 2和Bax的蛋白表达水平。具体操作参照试剂说明书进行。

1.2.4 RT-qPCR检测lncRNA GASL1表达：Trizol法提取总RNA，反转录得到cDNA。在cDNA中加入PCR荧光试剂和引物于ABI- 7300 PCR仪进行扩增和检测。ABI- 7300系统分析得到lncRNA GASL表达量。引物序列如下： GASL1上游引物5′-CTGA GGCCAAAGTTTCCAAC-3′，GASL1下游引物5′-CAG CCTGACTTTCCCTCTTCT-3′；GAPDH上游引物5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，GAPDH下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.2.5 Western blot 检测蛋白表达:收集细胞，加入蛋白裂解液(WIP 裂解液∶PMSF=100∶1)，裂解1 h后离心，吸取上清，加入上样缓冲液变性(99 ℃，7 min)，运用 BCA 蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度。具体操作参照试剂说明书进行。

制备 10%的分离胶和浓缩胶，根据上述测定的蛋白浓度计算上样体积(20 μg 总蛋白)，控制电压和时间(80 V，30 min；120 V，1 h)进行电泳，湿转法转膜，PVDF 膜孵育一抗(Bax和 Bcl- 2，均1∶1 000)4 ℃过夜，TBST漂洗，加入二抗室温孵育1 h，TBST漂洗，置于自动显影仪(ChemiDocXRS 成像系统)显影。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 乳腺癌患者癌组织中lncRNA GASL1表达水平降低

30例乳腺癌患者的癌组织和癌旁正常组织均经雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)免疫组化验证(图1A)，且发现乳腺癌组织中lncRNA GASL1表达水平相对癌旁正常组织降低(图1B，P<0.05)。

2.2 乳腺癌细胞系中lncRNA GASL1的表达水平降低

相比人正常乳腺细胞HBL- 100，乳腺癌细胞MCF- 7、MDA-MB- 468、MDA-MB- 231和SK-BR- 3中lncRNA GASL1的均表达降低(P<0.05)，且MCF- 7表达水平降低最显著(图2)，故选用MCF- 7用于后续实验。

2.3 过表达lncRNA GASL1可抑制MCF- 7的增殖，促进其凋亡

相比空白质粒(pcDNA3.1)，pcDNA3.1-GASL1能有效的过表达lncRNA GASL1(图3A)。MCF- 7细胞经pcDNA3.1-GASL1过表达GASL1可抑制MCF- 7细胞增殖，且呈时间依赖性(图3B)。caspase- 3活力、 Bcl- 2和Bax水平是反映细胞凋亡的重要指标。过表达lncRNA GASL1可增强caspase- 3活力、减少Bcl- 2表达和增加Bax表达(图3C～E)，即过表达lncRNA GASL1可促进MCF- 7细胞凋亡。上述一系列实验结果表明，过表达lncRNA GASL1可抑制MCF- 7的增殖，促进其凋亡。

A.ER and PR immunohistochemical analysis(×200); B.lncRNA GASL1 expression was down-regulated in breast cancer tissue; *P<0.05 compared with paracancerous tissues

*P<0.05 compared with HBL- 100

2.4 干扰lncRNA GASL1表达可促进MCF- 7增殖，抑制其凋亡

相比无关序列NC片段，3个siRNA片段均能有效的干扰lncRNA GASL1的表达，其中片段1的干扰作用最强(图4A)，用于后续细胞功能研究。MCF- 7细胞经siRNA片段1干扰lncRNA GASL1表达可促进MCF- 7细胞增殖，且呈时间依赖性(图4B)。此外，lncRNA GASL1 siRNA可降低细胞caspase- 3活力、增加Bcl- 2表达和减少Bax表达(图4C～E)， 即干扰lncRNA GASL1表达可抑制MCF- 7细胞凋亡。上述一系列实验结果表明，干扰lncRNA GASL1表达可促进MCF- 7的增殖，抑制其凋亡。

A.transfection with pcDNA3.1-GASL1 significantly up-regulated the expression of lncRNA GASL1; B.transfection with pcDNA3.1-GASL1inhibited the proliferation of MCF- 7; C.transfection with pcDNA3.1-GASL1 increased the activity of caspase- 3; D, E.transfection with pcDNA3.1-GASL1 down-regulated the expression of Bcl- 2 and up-regulated the expression of Bax; pcDNA3.1.empty plasmid; *P<0.05 compared with pcDNA3.1

A.transfection with 3 si-GASL1 segments significantly down-regulated the expression of lncRNA GASL1; B.transfection with si-GASL1 promoted the proliferation of MCF- 7; C.transfection with si-GASL1 decreased the activity of caspase- 3; D, E.transfection with si-GASL1 up-regulated the expression of Bcl- 2 and down-regulated the expression of Bax.si-NC: negative control sequence; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with si-NC

3 讨论

人类基因组中70%～90%的基因序列可转录为RNA， 仅有2% 的 RNA具有编码蛋白质的功能，这些不具有编码蛋白质功能的RNA称为非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，根据长度又可分为短链ncRNA(≤200 nt)和长链ncRNA(>200 nt)[5]。长链ncRNA(lncRNA)作为原癌基因或抑癌基因在乳腺癌中广泛存在，且与乳腺癌发生发展密切相关[6]。

lncRNA HOTAIR 的异常表达是乳腺癌的独立预后因素[7]，HOTAIR 在原发性乳腺癌中的表达量是正常乳腺上皮的 125 倍，在转移性乳腺癌中超过正常乳腺上皮的2 000倍[8]，且 HOTAIR 的过表达与患者远处转移及不良预后相关。研究发现，将乳腺癌细胞的 MALAT1 基因敲除后，不仅肿瘤细胞的增殖过程被抑制、其侵袭性和转移力也明显下降[9]。另有研究报道，lncRNA除了参与乳腺癌疾病的发生发展还参与乳腺癌耐药性的调节。乳腺癌患者接受他莫昔芬治疗后，高表达 BCAR4 患者的无进展生存期(PFS)和 总生存期(OS)都较低表达的患者短[10]。在他莫昔芬敏感细胞系ZR- 75- 1 中过表达BCAR4 能显著降低他莫昔芬抑制肿瘤细胞的增殖能力，说明BCAR4 可能与乳腺癌对他莫昔芬耐药相关。

新近研究发现了一个新的lncRNA-GASL1[4]，进一步研究发现：1) GASL1参与调控细胞周期，可促进细胞由G1向S期转化；2)运用siRNA干扰人骨肉瘤细胞U2OS中GASL1表达可促进细胞增殖和集落形成；3)运用敲除GASL1的U2OS细胞和野生型U2OS建立异种移植建立的荷瘤小鼠模型，GASL1敲除的U2OS小鼠癌组织生长速率比野生型U2OS更快；4)肝癌患者肝癌组织中GASL1的表达水平与患者的生存周期呈正相关。上述一系列研究表明，GASL1可能是又一个新的参与癌症发生发展的lncRNA。本研究发现， GASL1乳腺癌患者癌组织和乳腺癌细胞系中表达减少，提示GASL1可能参与调节乳腺癌功能。进一研究发现，过表达GASL1可抑制MCF- 7的增殖，促进其凋亡；干扰GASL1表达可促进MCF- 7的增殖，抑制其凋亡。

综上所述，本研究首次发现lncRNA GASL1在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中表达降低，通过调节乳腺癌细胞增殖和凋亡参与乳腺癌的发生发展。GASL1可能是防治乳腺癌的新靶点和诊断乳腺癌的新型生物标志物。GASL1调节乳腺癌细胞增殖和凋亡的具体机制和是否参与乳腺癌耐药尚不清楚，这将是我们下一步研究的重点。