无创性免核酸提取的多重SNP基因分型技术

赵 烨，赵亚玲，周 军，郑 直

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系， 北京 100005)

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)被认为是疾病易感性和药物反应的决定因素[1]，约有105个SNP分子标记被用于基因功能及疾病相关性研究[2]。此类研究需要简单而低成本的方法来获得大规模的核酸。当前的样品类型多源于血液，需要提取核酸。血液采集需要专业人员及特殊器材，还可能引起一些潜在的病源传播。大量核酸提取费时费力，成本高不易开展。目前在大规模SNP基因分型上仍无一种可用于无创性样品的高效简便的核酸获取方式。故建立一种无创性且免核酸提取的多重SNP基因分型技术具有很大的应用价值。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)缺乏症的实质是G6PD发生单碱基错义突变导致的酶活性降低[3]。疟疾流行国家G6PD 缺乏症发病率高达8%[4]，而抗疟药伯氨喹啉(primaquine)可诱发G6PD 缺乏症患者发生溶血[5]。进行G6PD突变型筛查可为伯氨喹啉的使用提供预先风险评估。本研究将以G6PD SNP检测作为应用对象，建立适用于无创性样品免核酸提取的多重SNP基因分型技术。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品：包括来自健康受试者的的血液，唾液及口腔拭子，及来自中缅边境7例间日疟口腔拭子样品。所有样品均获得伦理委员会审批及受试者知情同意。

1.1.2 主要试剂：唾液及口腔拭子DNA提取试剂盒、血液DNA提取试剂盒、蛋白酶K， T4 DNA ligase(北京康为世纪生物科技有限公司)；Spectro CHIP芯片和树脂试剂盒、iPLEX Gold试剂盒(Agena Bioscienc公司)；T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA polymerase、dNTP(New England Biolabs，NEB公司)；EasyTaq DNA polymerase (北京全式金生物技术有限公司)；牛血清白蛋白(北京鼎国昌盛生物有限公司)；裂解液(Affymetrix公司)；捕获板、洗液(Diacutate公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品采集：保证受试者在过去30 min内没有进食，饮水，抽烟等。唾液采集之前用舌头刮上下颚10～15次保证脱落细胞的数量，后将唾液收集于2 mL 离心管内；收集口腔拭子时，持口腔采样棉签在内壁黏膜旋转 10～15 圈，然后再上下移动刮拭5～10次，力度适中，以紧贴口腔内壁黏膜为宜，确保拭子各处都能蘸取口腔黏膜脱落细胞，剪去拭子多余木棒部分，置于2 mL离心管内。

1.2.2 G6PD序列以及23个SNP位点选取：采用G6PD的cDNA在GenBank中序列标识符为X03674(version:X03674.1 GI:31542)，检测中国人中最常见的G6PD的23个突变位点[6]。

1.2.3 无创性免提取核酸的多重SNP分型法：每100 μL裂解体系包括：裂解液33.3 μL(3X)、蛋白酶K 5 μL(20 mg/mL)，探针混合物1 μL(0.1 mmol/L)、反向通用引物2 μL(0.1 mmol/L)、样品(18～58 μL唾液/一个口腔拭子)和去离子水，56 ℃剧烈摇动30 min进行裂解反应。后将裂解产物转移至捕获板中98 ℃加热5 min后55 ℃过夜孵育完成捕获反应。结合基于延伸连接的多重探针扩增(multiplex extension and ligation-based probe amplification,MELPA)技术[6]对模板进行信号放大。最后进行单碱基引物延伸及质谱分析。质谱数据利用MassARRAY®分子量阵列技术TyperAnalyzer软件4.0版(Agena Bioscience公司)进行分析。每次实验设4个样品，每个样品做3个重复对G6PD 23个SNP位点进行检测。统计每个分型结果可信度等级，分为A、B、C和D级(A:conservative、 B:moderate、C:aggressive、 D:low probability)，可信度依次递减[7]。可信度等级为A，B或C表示SNP检测获得成功，成功率(call rate)表示所有样品所有SNP成功检测数占总检测数的比例[8]。设流行病学研究中常用的标准 95%成功率为界限[9]。

1.2.4 商业化SNP检测法iPLEX：iPLEX GOLD技术可以设计最多达40重PCR反应和基因型检测，实验设计灵活，分型结果准确。提取血液(200 μL/assay)基因组DNA。通过探针设计软件2.0版(Agena Bioscience，San Diego，CA; https://www.agenacx.com)设计G6PD基因的23个突变检测的多重iPLEX反应引物，使用iPLEX市售试剂盒进行测定。以MassARRAY Typer分析仪软件版本4.0(Agena Bioscience)分析质谱数据。

1.2.5 测序法检测SNP：利用primer5软件设计了覆盖23个G6PD SNP位点序列的14条引物。提取样品DNA，进行总体积为50 μL的PCR反应(0.4 μmol/L引物，25 μL Premix Taq，水和模板)。使用3730自动测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)对PCR产物进行Sanger测序。

1.2.6 方法评价：用本方法及市场上普遍使用的以血液为样品的iPLEX技术对G6PD 23个SNP位点进行3 d、4个样品、3个重复共828个反应的分型检测，以测序法作为金标准比对。可靠性以结果可信度分别为A、B、C和D等级的检测结果数占总检测数的百分比来表示；重复性以3个重复孔分型结果均一致的检测数占总检测数的比例来表示；准确性以与测序结果一致的检测数占该位点总检测数的比例来表示。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 无创免核酸提取的基因分型检测方法

结合质谱技术对唾液与口腔咽拭子样品SNP进行高通量检测，建立的无创免核酸提取方法可成功对G6PD的23个SNP进行基因分型，成功率大于95%。

2.2 唾液样品条件探索

2.2.1 反应所需最低样品量：当样品量大于18 μL时分型结果的成功率均为100%，尽管从这些样品提取出的DNA含量波动很大(±50.8 ng)。当样品量减少至10 μL时成功率则下降至95%以下。

2.2.2 样品保存时间及保存方式：室温保存至11周或-20 ℃保存4周的唾液样品都可满足实验要求，分型结果的成功率均大于99%。

2.3 方法的可靠性、重复性及准确性评价

本方法低质量分型结果(D:low probability)仅0.12%，以血液为样品的iPLEX技术则为3.86%(图1A)；在第2次重复测定时iPLEX与MELPA重复性有差异(P<0.01)(图1B)；所有成功的分型结果中，本方法的分型结果都与测序结果相同。而iPLEX在159SNP位点上获得正确的分型结果仅为52.8%，825位点则为0%(图1C)。对比测序结果发现iPLEX会提供错误的杂合或半合子突变结果(表2，括号内表示可信度等级)。

2.4 在疟疾流行区G6PD基因突变检测中的应用

筛查结果发现，这7例患者的G6PD均为野生型无突变，服用伯氨喹啉后进行定期随访亦未见该7例用药的间日疟患者发生溶血现象，即临床表现符合本方法所得分型结果的基因表现型。

表1 唾液保存条件对分型结果的影响Table 1 Effect of saliva preservation conditions on genotyping results

A.call quality distribution; B.reproducibility of the genotype results for each assay on each day; C.genotyping call accuracy for the 23 G6PD SNP sites; *P<0.01 compared with MELPA in day 2

3 讨论

本研究以无创性的唾液及口腔拭子为样品，避免血液采集带给受试者的不适感而拒绝采样或者造成潜在病源传播等缺陷；解决了基层大规模SNP筛查采样时需要专业技术人员及特殊器材等问题；对保存条件要求不高(表1)，便于储存及运输。该法无需核酸提取，简化了实验操作、缩短了检测时间、降低了检测成本且在很大程度上解决了现有DNA提取技术中可能出现的样品交叉污染，核酸质量参差不齐等问题。

实际操作中唾液收集效果不确定，导致从唾液中提取出的DNA 量有所区别，从而出现不同实验室或不同基因分型技术以唾液作为检测样品时所测得的结果及效果并不完全一致[10]。有时也因为样品珍贵或者样品量小而不能进行DNA提取。而本方法无需提取核酸，避免了因DNA提取带来的含量及质量的差异，将唾液裂解后直接进行检测，经过多次实验(表1, 图1)，不同人不同时间及不同质量的唾液样品，20 μL的样品量足以满足实验要求。

相比于目前最为流行的商品化SNP分型检测方法——以血液为样品的iPLEX技术，本方法在可靠性、重复性方面的表现与之相当甚至更优，在准确度上明显高于iPLEX(图1 )。iPLEX在159和825这2个位点的检测上重复性较差，且会出现错误结果(表2)。

在测试本方法临床应用的效果时，受试者均提供了口腔拭子样品，该样品采集后保存于离心管内经过邮寄到达北京进行检测，直至检测时该样品在室温存放了3周，显示口腔拭子样品可长期保存，对保存条件要求不高，并更易被受试者接受。

表2 两种方法的差异结果Table 2 Discrepant results between two methods

本技术可成功进行人群G6PD突变筛查，对疟疾流行区的等位基因突变频率及伯氨喹啉用药风险评估具有重要的意义。在精确医学如靶向治疗的药物基因组学和突变检测中，该方法将是一种大规模人群筛查的有用工具。