多巴胺转运体基因多态性与帕金森病的易感性及PET/CT显像

常培叶 赵 平 王雪梅 王春梅 包宝亮

(内蒙古医科大学附属医院核医学科，内蒙古 呼和浩特 010050)

帕金森病(PD)是中老年人常见的神经退行性疾病，主要病理特征是黑质多巴胺能神经元的变性，导致脑内多巴胺含量减少，临床表现为静止性震颤、运动迟缓、自主运动减少等。PD发病率随着年龄增加而逐渐升高，在我国北京、西安和上海的PD流行病学调查发现，PD在65岁以上人群中的发病率为1.7%，已经接近发达国家〔1〕。研究认为PD是一种复杂的多因素疾病，它的发病受到环境〔2〕和遗传因素的共同影响，其中遗传因素起主要作用〔3〕。多巴胺转运体(DAT，基因名：SLC6A3)是调节突触间隙多巴胺浓度的关键蛋白质，DAT的主要功能是对释放到突触间隙的多巴胺进行再摄取，从而终止神经细胞间的信息传递〔4〕。研究〔5，6〕表明，DAT基因变异与PD的易患性有关。本研究DAT基因3′非翻译区可变串联重复序列(VNTR)多态性与内蒙古地区PD的相关性，分析VNTR多态性与纹状体DAT11C-甲基-N-2β-甲基酯-3β-(4-F-苯基)托烷(11C-β-CFT)脑显像摄取之间的关联性，探讨DAT基因VNTR变异在内蒙古地区PD发病中的作用。

1 材料和方法

1.1研究对象 选取2015年就诊于内蒙古医科大学附属医院门诊及住院的PD患者52例为PD组，其中男23例，女29例；年龄40～70岁，平均(62±3.24)岁；霍思亚布尔(Hoehn-Yahr)评分1.0～2.0，平均1.5。纳入标准：①符合英国PD协会脑库标准制定的PD诊断标准，以及中华医学会神经病学会制定的PD诊断标准。②患者口服美多巴制剂后疗效明显，且均未接受过PD颅内手术治疗。③排除帕金森综合征、脑血管疾病、中毒、颅内感染、颅脑外伤等器质性病变，以及血管性痴呆、路易体痴呆、阿尔茨海默病等神经系统变性疾病。④排除阳性家族史，即该PD患者的一级或二级亲属，既往均无PD、阿尔茨海默病、路易体痴呆等神经系统变性疾病。内蒙古医科大学附属医院健康体检人员60例为对照组，男29例，女31例，年龄40～70岁，平均(54±2.58)岁。入选者为与PD组患者年龄、性别匹配的健康志愿者，且满足以下条件：①对照组与PD组及对照组个体之间均无血缘关系。②排除PD、阿尔茨海默病、路易体痴呆等神经系统变性疾病病史，且无服用精神病药物史。两组均知情同意且性别、年龄一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2DAN提取方法 采用试剂盒法进行DNA的提取并进行DNA浓度、纯度检测。

1.3VNTR多态位点基因分型方法 采用高温连接酶检测反应(LDR)进行VNTR多态位点的基因分型。①PCR扩增。PCR反应体系如下：1×缓冲液2 μl，20 ng 模板1 μl，3 mmol/L镁离子(Mg2+)0.6 μl，2 mmol/L/脱氧核苷三磷酸(dNTP)2 μl，1 U DNA聚合酶(Taq)0.2 μl，1×溶液4 μl，0.5p引物混合物2 μl，水8.2 μl，总体积20 μl。PCR 反应条件：起始95℃变性15 min，然后94℃ 30 s，62℃ 1 min，72℃ 1 min，反应35个循环，最后72℃延伸10 min。反应结束后用3%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。②LDR进行基因分型。LDR反应体系如下：1×缓冲液1 μl，12.5 pmol/μl/探针混合物1 μl，2 U连接酶0.05 μl，100 ng/μl PCR产物1 μl，水6.95 μl，总体积10 μl。反应条件：95℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃ 2 min，反应35个循环。反应结束后，用GeneMapper 3.0软件进行数据分析和基因分型。

1.411C-β-CFT DAT正电子发射计算机断层显像(PET)/CT脑显像 20例临床确诊PD患者和10例对照者使用GE Discovery 710 显像设备进行DAT PET-CT显像研究，受试者经肘静脉注射11C-β-CFT 30 min后进行DAT脑显像，采集模式为3D，发射采集计数为3×10计数，取CT图像中纹状体影像最清晰的3帧横断层图像，在每一层面上分别勾画出双侧尾状核、双侧壳核及小脑(CB)感兴趣区(ROI)，用计算机软件自动得出各ROI的平均放射性计数，计算各区 DAT 结合量指数：(ROI-CB)/ CB，以三层的平均计数计算此比值，获得这些区域的11C-β-CFT摄取指数，以此来反映这些区域DAT的数量。为保证 ROI 的大小与位置在每一位受试者间的一致性，ROI均由 1 名核医学专业主治医师独立勾画。

1.5统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1VNTR多态性分析 VNTR的基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。VNTR有9R和10R两个等位基因，VNTR基因型频率和等位基因频率在对照组和PD组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2纹状体11C-β-CFT放射性计数分析 对照组DAT显像清晰放射性摄取均匀对称。与对照组比较，PD组双侧尾状核、前壳核和后壳核摄取11C-β-CFT放射性计数比值显著减低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、图2、表2。

表1 两组VNTR基因多态性比较〔n(%)〕

图1 对照组11C-β-CFT-PET-DAT脑显像图

图2 PD组11C-β-CFT-PET-DAT脑显像图

表2 两组纹状体11C-β-CFT-PET-DAT显像结果比较

与对照组比较：1)P<0.05

2.3相关性分析 纹状体11C-β-CFT放射性计数与VNTR的10R-10R、10R-9R、9R-9R的基因型频率无明显相关性(P>0.05)。

3 讨 论

人类DAT基因由SLC6A3基因编码，位于染色体5pl5.3，包含15个外显子，全长64 Kb。其编码区表现出较强的保守性，因此SLC6A3基因表达的个体差异可能来自于调控序列，研究较多的是其3′非翻译区(3′UTR)一个40 bp串联重复序列VNTR的多态性，有研究表明，VNTR多态会影响DAT基因的表达，并与PD的易患性有关〔7〕。在高加索人群和中国广州人群的两项研究中均发现11次拷贝重复等位基因导致基因表达的增强，使神经毒素进入多巴胺能神经元增多，最终导致多巴胺能神经元变性坏死〔8〕。但部分研究结果不支持DAT基因多态与PD的关联〔9〕，其原因可能在于人种、种群和地域的差异。借助单光子发射计算机断层显像(SPECT)和PET技术，使人们能够在活体内对与疾病发生、发展密切相关的生物学标志物进行检测〔10〕，相比于SPECT显像，PET显像具有更高的空间分辨率和图像质量，显示出更明显的应用优势〔11〕。研究〔12〕表明，PD患者黑质纹状体多巴胺神经元的变性脱失伴随突触前膜DAT数量及功能的明显下降，两者的变化相一致。DAT显像可用于评价纹状体突触前的多巴胺能神经纤维末梢的功能状态，是目前最敏感的PD标志物。本研究发现DAT基因的VNTR 3种基因型频率分布在对照组和PD组并没有统计学差异，且未发现纹状体11C-β-CFT放射性计数与VNTR基因型之间的相关性。这可能是由于样本量太小，在今后的研究中需增加样本量，根据年龄、性别及发病特征等进行详细分类统计。尽管本研究未能得出基因位点突变与PD遗传易感性有关的结论，但这并不能排除其在PD发病中的作用， 有待进一步研究。