肠道菌群失调加重小鼠局灶性脑缺血再灌注后炎性反应

李元培， 韩 晋， 纪明慧， 董瑞宾， 石艳超

人类肠道至少含有1000种菌群，共计超过100万亿个细菌[1]。饮食习惯、生活方式、卫生习惯、遗传因素、抗菌药的使用等都会影响肠道菌群的种类和丰富度[2，3]，同时其在体内数量和比例呈现动态改变。炎性反应是脑缺血再灌注损伤 (cerebral ischemia reperfusion injury,CIR)中复杂的级联反应之一，涉及多种炎性介质、炎性细胞及炎症反应通路，阻断CIR中炎性反应可显著减轻脑损伤。有研究表明[4]，肠道菌群失调与心脑血管疾病的发生密切相关，其通过炎性反应促进动脉粥样硬化的形成。

本实验通过构造脑缺血再灌注动物模型，观察肠道菌群失调对小鼠脑缺血的影响、神经功能缺损和脑水肿的程度，血脑屏障功能-即ZO-1表达的情况，以及IL-6、TNF-α和NF-κB炎性标志物的变化，旨在探讨肠道菌群失调对CIR中炎性反应的影响，以期为临床治疗脑梗死提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及处理 SPF级健康6 w龄性C57BL/6J小鼠，雄性，体重(20±2)g饲养于SPF环境设施。饮用水经高压灭菌消毒，饲料经钴60照射处理。随机分为假手术组、缺血再灌注组(对照组)和菌群失调组。造模前4 d始，假手术组和对照组胃内注入同体积的生理盐水0.2 ml，菌群失调组胃内注入100 mg/ml的头孢曲松溶液0.2 ml，每天两次，时间间隔8 h，连续灌胃4 d。

1.2 小鼠CIR模型制作 参照文献[2]报道的Zea Longa法制备改良线栓法大脑中动脉栓塞模型。术前禁食12 h，不禁饮。腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉，仰卧位固定于37 ℃恒温电热板上。取颈部正中切口，游离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈总动脉近心端，以无创血管夹夹闭颈总动脉远心端及颈外动脉，于颈总动脉分叉下方剪开一切口，放置预先头端钝化处理的尼龙线(北京西浓科技有限公司)，缓慢推进8～10 mm，感觉有阻力时停止，固定于颈总动脉。栓塞1 h后，拔出线栓恢复血流。单笼饲养，自由饮食。再灌注后2 h采用神经功能评分验证造模是否成功，即造模小鼠出现右侧Horner征和左侧以上肢为重的偏瘫，作为动物模型成功的判定标准，剔除不符合标准或死亡的动物，并随机补充。假手术组除不插入线栓外其余相同。

1.3 小鼠神经功能评定 于再灌注后72 h时，进行神经功能评分，参照Zea Longa评分标准：0分,无神经损伤症状；1分,轻微神经功能缺损，不能完全伸展对侧前爪；2分,重度局灶性神经功能缺损，向对侧转圈；3分,重度局灶性神经功能缺损，向对侧倾倒；4分,不能自发行走，意识丧失。

1.4 肠道菌群培养及计数 脑缺血再灌注后72 h，无菌条件下取升结肠内容物，称重后立即将其稀释成10～7浓度，然后分别接种于肠球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的相应培养基中，肠球菌培养基置于35 ℃孵育箱内培养24 h，乳酸杆菌和双歧杆菌培养基置于35 ℃厌氧培养箱中培养48 h，并对相应菌群进行检测。结果以每克升结肠内容物湿重中菌落形成单位的对数值表示(lg CFU/g)。

1.5 脑梗死体积的测定 取再灌注后72 h的小鼠，断头取脑置于-20 ℃冰箱内30 min，自视交叉水平行5个脑冠状切片，片厚约2 mm，将其置于2%的TTC溶液中，37 ℃避光孵育30 min，染色后置于10%甲醛溶液中于4 ℃避光固定24 h，肉眼观察并拍照。应用Image J 软件计算脑梗死体积，公式为：脑梗死体积(%)=[总的梗死体积-(右侧半球体积-左侧半球体积)]/左侧半球体积×100%。

1.6 脑组织含水量的测定 再灌注后72 h，经神经功能评分后，立即将小鼠断头处死。取缺血侧脑组织迅速称其湿重，然后置于100 ℃高温烤箱内，烘干48 h后称其干重。按照Elliott公式，计算出脑含水量，公式为：脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.7 Western blot法检测缺血侧脑组织NF-κB p65和ZO-1的表达 取再灌注后72 h的小鼠，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉后，冰PBS心脏灌流，断头取脑。取缺血侧大脑半球，提取脑组织蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒(赛默飞世尔科技)检测蛋白浓度。每孔加入等量蛋白，10%SDS-PAGE凝胶进行电泳，然后转移至甲醇浸泡过的PVDF膜上，1.5%胎牛血清室温封闭1 h后，分别加入NF-κB p65一抗(1∶1000,CST)、ZO-1一抗(1∶500,CST)和β-actin一抗(1∶2000,Santa Cruz)，室温孵育12 h后，置入4 ℃冰箱过夜。加入二抗(1∶5000,Transgen Biotech)，室温孵育2 h。每个条带加入显影液发光，采用Image J软件测定灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值反应目的蛋白的表达水平。

1.8 实时定量PCR 取每只小鼠缺血侧大脑半球 获得总 RNA后取10 μl按照反转录酶Ⅱ试剂盒行逆转录操作。扩增条件为：95 ℃预变性30 s，进入循环，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共循环40次，随后95 ℃延伸15 s，60 ℃延伸1 min，95 ℃再延伸15 s，最后降至4 ℃。分别得到IL-6、TNF-α和内参β-actin的Ct值后，采用相对定量的方法计算，△Ct=目的基因Ct值-内参基因Ct值。以2-△Ct为指标，分别计算出IL-6、TNF-α和内参β-actin mRNA的相对表达水平。实验重复3次，求得平均值作为分析结果。

2 结 果

2.1 肠道菌群计数 缺血再灌注后72 h，取小鼠升结肠内粪便进行培养、计数。假手术组和对照组肠道内菌群无差异(P>0.5)。菌群失调组小鼠肠球菌增多，乳酸杆菌及双歧杆菌减少，与假手术组及对照组相比存在差异(P<0.05)(见表1)。

2.2 神经功能评分 小鼠取材前进行神经功能评分。假手术组因未阻塞大脑中动脉，未出现神经功能缺损症状，评分均为0分。与假手术组比较，对照组和菌群失调组的神经功能评分较高(P<0.05)；与对照组比较，菌群失调组神经功能评分较高(P<0.05)(见表2)。

2.3 脑梗死体积和含水量的测定 假手术组小鼠脑组织未见脑梗死区域，对照组可见明显脑梗死灶(P<0.01)，与对照组相比，菌群失调组脑梗死灶体积明显增大(P<0.05)(见图1)；3组间脑含水量有明显差异(P<0.05)，菌群失调组脑含水量较对照组高(P<0.05)(见表3)。

2.4 NF-κB p65和ZO-1蛋白的表达量 与假手术组比较，对照组和菌群失调组的NF-κB p65表达明显上调(P<0.05);与对照组比较，菌群失调组的NF-κB p65的表达增加(P<0.05)。与假手术组比较，对照组和菌群失调组的ZO-1表达明显减少(P<0.05);与对照组比较，菌群失调组ZO-1的表达减低(P<0.05)(见图2、表4)。

2.5 IL-6和TNF-α表达量 与假手术组比较，对照组和菌群失调组的IL-6和TNF-α mRNA相对表达量明显升高(P<0.05);与对照组比较，菌群失调组的IL-6和TNF-α mRNA相对表达量明显升高P<0.05)(见表5)。

表1 灌胃5 d小鼠肠道菌群的分布

与假手术组相比较*P>0.05；与菌群失调组相比较#P<0.05

表2 脑再灌注后72 h各组小鼠神经功能评分

与假手术相比较*P<0.05；与对照组相比较#P<0.05

表3 脑再灌注后72 h各组小鼠脑梗死体积及脑含水量比较

与假手术组相比较*P<0.05；与对照组相比较#P<0.05

表4 脑再灌注后72 h各组小鼠脑组织NF-κB p65和ZO-1的表达量

与假手术组相比较*P<0.05；与对照组相比较#P<0.05

表5 脑再灌注后72 h各组小鼠脑组织IL-6 mRNA和TNF-α mRNA 相对表达量

与假手术组相比较*P<0.05；与对照组相比较#P<0.05

图1 脑再灌注后72 h各组小鼠脑梗死体积

图2 再灌注后72 h，各组小鼠梗死侧脑组织NF-κB p65 和ZO- 1印迹条带

3 讨 论

肠道菌群参与生命早期肠道免疫的形成，机体的慢性感染可促进动脉粥样硬化发生、发展。肠道菌群可影响宿主的新陈代谢、免疫反应和炎症反应[5]。通过分析微生物的功能组学发现，症状性动脉粥样硬化患者肠道菌群富含编码肽聚糖合成的基因，肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分，可能通过激活机体免疫系统和中性粒细胞引起动脉粥样硬化[4]。动脉粥样硬化是脑卒中最常见的病理过程，血管炎症是动脉粥样硬化的重要环节。病理状态下，微生物激活机体固有免疫系统，促进炎性反应，加重血管炎症[6]。有研究发现，通过肠道菌群移植可增加血栓风险[7]。

也有研究表明证实，肠道菌群的代谢产物可通过激活免疫系统，加重血管壁炎症，促进动脉硬化。少量肠道细菌可进入血液循环，引起全身慢性低度炎症，这种慢性炎症在动脉粥样硬化中普遍存在[8]。肠道菌群失调参与代谢性和炎症性疾病的发生和进展，因此保持肠道菌群稳态尤为重要。然而，其在脑梗死中的作用尚未见报道。

CIR损伤的机制主要包括兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、一氧化碳失调控、炎性反应等。炎性反应在CIR损伤中起着关键作用，加重了脑损害[9]，其病理基础以IL-6和TNF-α等为代表的多种炎性介质失控、释放而形成“瀑布效应”，引起继发性神经细胞变性、坏死、凋亡等[10]。IL-6是触发炎性反应的重要介质之一，脑缺血后其表达增多，对神经元有毒性作用，目前认为其是急性缺血期脑损伤程度的一个标志[11]。TNF-α是中枢神经系统参与炎性反应和免疫应答的重要介质，其可激活小胶质细胞、破坏BBB、促进炎性细胞的迁移，最终对神经元造成损伤[12]。

基于以上研究，我们推测，肠道菌群失调通过影响免疫炎症反应加重了脑梗死的病情。

CIR模型是研究脑梗死较好的动物模型，脑梗死的体积直接反映了脑损伤的严重程度，神经功能评分间接反映了病情的严重程度。本实验，成功制造了肠道菌群失调动物模型，发现菌群失调组的神经功能评分及脑含水量高于对照组，提示肠道菌群失调在一定程度上加重了CIR小鼠的神经功能缺损及脑水肿程度。我们的实验还发现CIR后，促炎因子IL-6和TNF-α于梗死侧半球异常过度表达，推测肠道菌群失调加重了其异常表达。在多种细胞中，缺血、缺氧诱发了NF-κB的活化[13]，活化的NF-κB诱导了细胞凋亡，加重了病情。菌群失调组中，NF-κB p65的表达明显增加，神经功能缺损评分升高，我们推测肠道菌群失调在一定程度上促进了NF-κB的活化。

ZO-1与BBB通透性的调节密切相关，其表达变化可作为衡量BBB损伤程度的标志，脑损伤后其表达明显下降，提示血BBB通透性增加[14]。为了解肠道菌群在CIR后对BBB的影响，我们观察了代表BBB功能的ZO-1的表达水平。实验中发现，与对照组相比较，菌群失调组中ZO-1的表达水平降低及脑水肿程度加重，由此，我们推测肠道菌群失调破坏了BBB的完整性。

综上所述，我们的研究发现，肠道菌群失调损害了BBB的完整性，在一定程度上加重了脑水肿程度和增加了脑梗死体积，促进了致炎性细胞因子的产生，增加了BBB的通透性，其机制可能是通过促进NF-κB的激活，对脑组织损伤起到了一定的促进作用。另外，患者脑梗死后，部分由于进食障碍、便秘、质子泵抑制剂的应用、抗生素的应用等因素造成肠道菌群失调，可能会加重脑梗死病情。提示我们在临床工作中，重视肠道菌群失调在脑梗死患者发病中的作用，为临床脑梗死治疗提供新的方向，纠正肠道菌群失调是治疗CIR后炎性反应的新靶点。