肿瘤相关巨噬细胞表达miRNA—122对肝癌患者的作用

徐炜 王文娟 欧阳良良

[摘要]目的 分析肿瘤相关巨噬细胞（TAM）表达miRNA-122对肝癌患者的作用。方法 选取2015年1月～2018年1月于我院进行诊断的20例肝癌患者作为HCC-1组，另选取20例健康者作为C-1组，分别提取两组患者的外周血单核细胞，采用q-PCR法检测两组患者的血清miRNA-122水平。选取40只健康SD裸鼠，将其随机分为HCC组（n=20）与Scamble组（n=20）。其中，HCC组采用皮下注射0.5 ml肝癌Hep-2细胞悬液，而Scamble组则皮下注射0.5 ml生理盐水。造模后，连续5 d采用腹股动脉取血法收集两组裸鼠模型动脉血，分离获取外周单核细胞，以q-PCR定量分析技术检测TMA中miRNA-122水平。结果 HCC-1组患者的miRNA-122水平显著低于C-1组，差异有统计学意义（P<0.05）。造模2 d后，HCC组裸鼠模型TAM中的miRNA-122水平显著低于Scamble组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 肝癌患者及肝癌裸鼠模型TAM中miRNA-122水平偏低，miRNA-122具有调控肝肿瘤生长的作用。

[关键词]肝癌；巨噬细胞；miRNA-122

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）7（c）-0127-03

[Abstract]Objective To analyze the effect of miRNA-122 expression in tumor associated macrophages （TAM） on hepatocellular carcinoma patients. Methods A total of 20 cases of patients with hepatocellular carcinoma dianosed in our hospital from January 2015 to January 2018 were selected as the HCC-1 group， and another 20 healthy people were selected as the C-1 group. The peripheral blood monocytes in the two groups were collected and the level of serum miRNA-122 was tested by q-PCR technology. Forty healthy SD nude mice were selected and randomly divided into the HCC group （n=20） and Scamble group （n=20）. The HCC group was injected subcutaneously with 0.5 ml Hep-2 cell suspension of liver cancer， while the Scamble group was given 0.5 ml normal saline. After modeling， arterial blood was collected from two groups of nude mice by abdominal femoral artery blood sampling for 5 consecutive days， and peripheral mononuclear cells were isolated and obtained. The level of miRNA-122 in TMA was tested by q-PCR quantitative analysis technique. Results The level of miRNA-122 in the HCC-1group was significantly lower than that in the C-1group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Two days after modeling， the level of miRNA-122 in TAM of nude mice in the HCC group was significantly lower than that in the Scamble group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The level of miRNA-122 in TAM of liver cancer patients and liver cancer nude mice is lower. The miRNA-122 plays a role in regulating the growth of liver tumors.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； Macrophages； MiRNA-122

肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）的发病率在世界范围内位列第5，在我国位列第3，且呈逐年上升趋势[1-2]。有研究表明，在HCC的发生、发展过程中，肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophage，TAM）与HCC相互影响、相互作用，促进肝癌发生和发展[3-4]。miRNA在免疫调控中起到重要作用，其中包括miRNA-122。本研究拟探讨TAM中的miRNA-122表达对肝癌的影响，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2015年1月～2018年1月在我院进行诊断的20例肝癌患者作为HCC-1组，男11例，女9例；年龄38～64岁，平均（45.3±6.4）岁；患者均为原发性肝癌。另选取20例健康人作为C-1组，男15例，女5例；年龄35～61岁，平均（41.8±7.1）岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会审核批准，所有患者均知晓本研究情况并签署知情同意书。

选取40只健康SD裸鼠，雄性，平均体重（200±25）g，由九江学院动物中心提供[合格证号：SCXK（赣）2007-0005]，将其随机分为HCC组与Scamble组，每组各20只。实时定量检测试剂盒、内切酶、荧光定量PCR检测引物、质粒提取试剂盒、人外周血淋巴细胞分离液于南昌长城生物公司购买。

1.2方法

1.2.1采集外周血TAM 分别采集两组患者的清晨空腹静脉血约10 ml，经3000 r/min离心10 min，保留分层液及以上部分于-24℃保存。采用q-PCR法检测两组患者外周血miRNA-122水平。

1.2.2构建肝癌裸鼠模型 HCC组20只裸鼠皮下注射0.5 ml肝癌Hep-2细胞悬液，密度约为1×105个/ml，建立肝癌裸鼠模型。Scamble组20只裸鼠于皮下注射0.5 ml生理盐水。造模后，每天分别在HCC组与Scamble组中随机选取4只裸鼠模型，采用腹股动脉取血法收集两组裸鼠模型血约5 ml，以3000 r/min离心10 min，保留分层液及以上部分于-24℃保存。采集造模后5 d两组裸鼠模型的外周血单核细胞。

1.2.3 q-PCR法检测miRNA-122水平 分别将HCC-1组、C-1组、HCC组与Scamble组得到的外周血单核细胞和TAM种植在6孔板中，经短暂孵育后提取总RNA，以miRNA-122特异性茎环引物进行反转录，以人U6做为内参，采用CT法对miRAN-122进行q-PCR定量分析[5-6]。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 HCC-1组与C-1组患者TAM中miRNA-122水平的比较

HCC-1组患者的miRAN-122水平[（0.52±0.21）ng/ml]显著低于C-1组[（0.84±0.43）ng/ml]，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 HCC组与Scamble组裸鼠TAM中miRNA-122水平的比较

造模2 d后，HCC组裸鼠TAM中的miRNA-122水平显著低于Scamble组，差异有统计学意义（P<0.05）（图1）。

3讨论

受肿瘤源性生长因子尤其是巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的影响，单核细胞在肿瘤微环境中分化为巨噬细胞，主要包括Ⅰ型巨噬细胞（M1）和Ⅱ型巨噬细胞（M2），二者均具有显著的可塑性、多功能性、极化性等特点[7-8]。但M1和M2巨噬细胞生理功能是绝然不同的。M1是一种典型的活化巨噬细胞，具有分泌促炎性因子、趋化因子、抗原提呈等作用，从而激发免疫应答，发挥免疫监视功能。而M2巨噬细胞为替代性活化巨噬细胞，其功能与M1巨噬细胞相反，其抗原提呈能力较弱，且促进IL-10与TGF-β表达，抑制免疫应答。此外，M2巨噬细胞还具有清除异物、促进伤口愈合、血管再生等作用[9-10]。因此，M2巨噬细胞可通过抑制抗原提呈细胞活性、促进T细胞增殖等方式降低肿瘤细胞免疫应答[11]。

TAM与肿瘤之间存在密切联系。一方面，肿瘤环境可影响单核巨噬细胞分化；另一方面，分化后的TAM又可抑制肿瘤免疫应答，促进肿瘤细胞生长发育。在肿瘤微环境中，单核巨噬细胞浸润到肿瘤组织后，肿瘤组织分泌的IL-6与IL-10因子可通过招募巨噬细胞聚集，产生PEG2，从而诱导并促进巨噬细胞分化为近似M2表型的TAM。而分化成熟的TAM直接分泌EGF、IL-6、CXCL-8等因子维持肿瘤细胞增殖，促进血管生成和抑制获得性免疫[12-13]。此外，TAM具有增殖、迁移、转移等肿瘤新生物的关键特征[14]，其水平与肿瘤生长和转移的下降率成负相关，且较多的临床研究表明，TAM增高与肿瘤患者预后不良成正相关[15-17]。

在肿瘤基质中存在许多巨噬细胞的分泌物，可直接刺激肿瘤细胞的生长和促进肿瘤细胞迁移和转移。这些因子包括上皮生长因子（EGF）、FGF家族因子、TGF-β、血管内皮生长因子、趋化因子和细胞因子。IL-1β可促进肿瘤转移。在IL-1β基因的敲除鼠中黑色素瘤细胞或乳腺、前列腺肿瘤均不会转移，表明了IL-1β在肿瘤微环境中的重要性。在与肿瘤细胞共培养的实验中，通过在巨噬细胞中TNF-α依赖的MMP诱导，巨噬细胞可增加恶性细胞的侵袭性[18]。在肺癌，通过促进基质和血管生长因子的生成，TAM可促进肿瘤的发展。

TAM产生和释放一些免疫调控因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10和IL-12[19-20]。据报道，这些因子可以直接或间接抑制抗肿瘤免疫反应，大量的实验与临床研究表明，TAM与癌症的发展密切相关。TAM产生上皮生长因子、血管内皮细胞、炎症细胞因子及趋化因子，促进肿瘤的存活、增殖和入侵[20]。此外，局部炎症或肿瘤细胞释放的免疫抑制介质削弱了宿主的抗肿瘤反应，并且促进肿瘤进展。

目前研究认为miRNAs与肿瘤形成密切相關，其中miRNA-122在肝脏中是特异表达，而且表达量较高。相关研究发现miR-122在肝癌组织中表达水平越低，肝癌分化越差，暗示着不良预后。

综上所述，肝癌患者及肝癌裸鼠模型TAM中的miRNA-122水平偏低，miRNA-122具有调控肝肿瘤生长的作用，临床研究需要进一步深入。

[参考文献]

[1]闫东，曾辉英，史仲华，等.甲磺酸阿帕替尼治疗中晚期肝细胞癌伴发乙型肝炎后肝硬化患者的临床疗效及安全性研究[J].中国肿瘤临床与康复，2018，25（2）：129-131.

[2]肖锋，顾春燕，钱铮，等.精氨酸酶2表达与肝细胞癌增殖凋亡及预后的关系研究[J].中国癌症杂志，2018，25（2）：105-110.

[3]范奇超，范丽玲，杨剑鑫，等.肝细胞癌组织中CD163的表达及其与血管、淋巴管生成的关系[J].郑州大学学报（医学版），2017，52（4）：438-442.

[4]Li H，Huang N，Zhu W，et al.Modulation the crosstalk between tumor-associated macrophages and non-small cell lung cancer to inhibit tumor migration and invasion by ginsenoside Rh2[J].Bmc Cancer，2018，18（1）：579.

[5]Mauger F，Kernaleguen M，Lallemand C，et al.Enrichment of methylated molecules using enhanced-ice-co-amplification at lower denaturation temperature-PCR（E-ice-COLD-PCR）for the sensitive detection of disease-related hypermethylation[J].Epigenomics，2018，10（5）：525-537.

[6]Zhang C，Wang J，Zhu L，et al.Effects of 1-octyl-3-methylimidazolium nitrate on the microbes in brown soil[J].J Environ Sci（China），2018，67：249-259.

[7]王祝荣，杨霞，何佳萌，等.宫颈癌患者T淋巴细胞亚群与自然杀伤细胞水平和病情的相关性[J].中国临床保健杂志，2018，21（2）：172-175.

[8]黄竹媛，甄俊平.肿瘤相关巨噬细胞：乳腺癌骨转移的“参与者”[J].中国药物与临床，2018，18（1）：45-46.

[9]顾胜蓝，孙笑，王玉东.M2型肿瘤相关巨噬细胞与子宫内膜癌相关性研究[J].中国实用妇科与产科杂志，2018，34（5）：555-558.

[10]王启船，王青，屈中玉，等.香菇多糖联合化疗对老年胃癌患者血清IL-2、IL-6及免疫功能的影响[J].中国老年学杂志，2018，38（7）：1609-1612.

[11]王永颖，田伟，孙超.联合用药对卵巢癌术后患者外周血D-二聚体、LPA与IL-6水平影响研究[J].中华保健医学杂志，2018，20（1）：69-70.

[12]Zhang YL，Li Q，Yang XM，et al.SPON2 promotes M1-like macrophage recruitment and inhibits hepatocellular carcinoma metastasis by distinct integrin-Rho GTPase-hippo pathways[J].Cancer Res，2018，78（9）：2305-2317.

[13]Fang M，Yuan J，Chen M，et al.The heterogenic tumor microenvironment of hepatocellular carcinoma and prognostic analysis based on tumor neo-vessels，macrophages and α-SMA[J].Oncol Lett，2018，15（4）：4805-4812.

[14]Kakoschky B，Pleli T，Schmithals C，et al.Selective targeting of tumor associated macrophages in different tumor models[J].PLoS One，2018，13（2）：e0193015.

[15]Meng YM，Liang J，Wu C，et al.Monocytes/Macrophages promote vascular CXCR4 expression via the ERK pathway in hepatocellular carcinoma[J].Oncoimmunology，2017，7（3）：e1408745.

[16]Fujisaka Y，Iwata T，Tamai K，et al.Long non-coding RNA HOTAIR up-regulates chemokine（C-Cmotif）ligand 2 and promotes proliferation of macrophages and myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma cell lines[J].Oncol Lett，2018，15（1）：509-514.

[17]于卫民，姬建胜，王冬冬.食管癌患者血清VEGF、TNF-α和IL-6的浓度变化与食管癌分期及转移的相关性研究[J].中国卫生工程学，2018，17（2）：292-293.

[18]梁辰飞.胆酸通过诱导肠道低度炎性反应激活IL-6/STAT3通路在肠腺瘤癌变中的作用[J].中国老年学杂志，2018， 38（4）：928-930.

[19]Zhang Q，Wang H，Mao C，et al.Fatty acid oxidation contributes to IL-1β secretion in M2 macrophages and promotes macrophage-mediated tumor cell migration[J].Mol Immunol，2018，94：27-35.

[20]Chen S，Zheng P，Wang W，et al.Abberent expression of NOR1 protein in tumor associated macrophages contributes to the development of DEN-induced hepatocellular carcinoma[J].J Cell Physiol，2018，233（6）：5002-5013.

（收稿日期：2018-05-14 本文編辑：孟庆卿）